如何生物3D打印管腔（血管）結(jié)構(gòu)

隨著組織工程領(lǐng)域的不斷發(fā)展，不斷有新的技術(shù)涌現(xiàn)出來(lái)，用于解決目前器官構(gòu)建中出現(xiàn)的痛點(diǎn)與難點(diǎn)。同軸生物3D打印技術(shù)的出現(xiàn)讓我們對(duì)血管化、精細(xì)化的組織器官打印提供了更多的可能性。本文帶您深入淺出的看懂這種技術(shù)和未來(lái)的發(fā)展空間。

組織工程

組織工程這一概念源于20世紀(jì)80年代中期，此項(xiàng)技術(shù)是指利用生物活性物質(zhì)，通過(guò)體外培養(yǎng)或構(gòu)建的方法，再造或者修復(fù)器官及組織的技術(shù)。這一基本技術(shù)路線使組織工程的研究能夠克服以往在臨床應(yīng)用的非活性的替代物的諸多缺點(diǎn)，使組織工程的研究在全世界范圍內(nèi)迅速得到了廣泛的關(guān)注。目前組織工程的研究已經(jīng)在構(gòu)建皮膚、軟骨、肝臟、胰腺、骨、肌肉、血管和神經(jīng)等組織器官方面取得了進(jìn)展。

生物3D打印技術(shù)是構(gòu)建組織和類器官的新興技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)運(yùn)用增材制造的思維，可以構(gòu)建含有活細(xì)胞的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)。近幾年，此項(xiàng)技術(shù)已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，然而隨著我們對(duì)于人造組織的精度、復(fù)雜度的不斷挑戰(zhàn)，過(guò)去通用的技術(shù)已經(jīng)難以滿足我們的需求，我們需要新的打印方法來(lái)解決組織器官構(gòu)建諸多問(wèn)題和局限性。

當(dāng)前技術(shù)的局限性

利用當(dāng)前的通用3D打印技術(shù)所構(gòu)建的組織器官具有以下幾種局限性：

1. 雖然我們可以將細(xì)胞或材料堆積成三維結(jié)構(gòu)，所打印的組織和類器官的血管化是組織工程的難點(diǎn)所在，傳統(tǒng)生物打印工藝采用線材螺旋堆積的形式進(jìn)行管腔結(jié)構(gòu)的打印，但是這樣的工藝僅能夠形成管腔結(jié)構(gòu)，難以實(shí)際應(yīng)用。所以，如何在人造組織中構(gòu)建出具有功能性的血管網(wǎng)絡(luò)或血管結(jié)構(gòu)是推進(jìn)組織工程向臨床發(fā)展的一大瓶頸。

2. 人體的組織器官形態(tài)多種多樣，其中很大一部分是具有復(fù)雜層次的結(jié)構(gòu)（如皮膚的表皮、內(nèi)皮細(xì)胞的分層結(jié)構(gòu)；腸道、尿道的管腔結(jié)構(gòu)等）。而生物3D打印作為一種構(gòu)建生物仿生結(jié)構(gòu)的工藝，需要一項(xiàng)可以構(gòu)建復(fù)雜層次或管腔結(jié)構(gòu)的工藝技術(shù)。

3. 微擠出式生物3D打印工藝是最廣泛使用的打印工藝，因?yàn)槠淇梢源蛴《喾N細(xì)胞和生物材料，并保有良好的細(xì)胞活性。但是，由于水凝膠類材料的擠出脹大，此工藝的精度往往有所限制。

4. 低黏度材料（如海藻酸鈉）的打印往往困難重重，對(duì)于這類材料，交聯(lián)固化的時(shí)機(jī)尤其重要：提前固化會(huì)導(dǎo)致打印噴頭的堵塞；后期固化會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)體精度較差。所以亟需一項(xiàng)可以對(duì)低黏度材料進(jìn)行原位固化的技術(shù)。

管腔結(jié)構(gòu)：傳統(tǒng)工藝（左）vs 同軸工藝（右）

同軸工藝解決方案

同軸噴頭系統(tǒng)是將生物3D打印機(jī)的兩個(gè)或多個(gè)噴嘴部分，像“俄羅斯套娃”一樣組合起來(lái)，以解決上述生物3D打印的各種痛點(diǎn)：

1. 由于同軸噴頭可以輕松地實(shí)現(xiàn)管腔結(jié)構(gòu)的打印，所以在構(gòu)建組織的血管化方面又有了新的突破。

2. 同軸噴頭技術(shù)由于其天生的多材料復(fù)合的特點(diǎn)，可以用于構(gòu)建具有層次或是管腔結(jié)構(gòu)的打印。

3. 由于同軸噴頭可以實(shí)現(xiàn)噴嘴出口處的快速交聯(lián)，所以此項(xiàng)技術(shù)可以構(gòu)建精度較高的結(jié)構(gòu)。

4. 同樣，基于同軸噴頭原位交聯(lián)的特點(diǎn)，低黏度的生物墨水打印的成功率和精度更高，有效的擴(kuò)充了應(yīng)用的材料范圍。哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院就是利用這樣的技術(shù)實(shí)現(xiàn)了高精度且低黏度的墨水打印

高精度、低黏度的同軸打印

Colosi C , Shin S R , Manoharan V , et al. Microfl uidic Bioprintingof Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink[J]. AdvancedMaterials, 2016, 28(4):677-684.

應(yīng)用案例

同軸噴頭技術(shù)的使用大大拓展了我們對(duì)于生物3D打印的想象空間，諸多研究者已經(jīng)開始應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)領(lǐng)域進(jìn)行耕耘，并在不同的組織或器官方面取得了進(jìn)展，下面我們來(lái)分享其中幾篇典型案例：

軟骨組織

軟骨的自愈能力和創(chuàng)傷響應(yīng)性較差，往往需要三維組織工程支架輔助修復(fù)。由波蘭華沙工業(yè)大學(xué)的Wojciech Święszkowski課題組于Biofabrication發(fā)表多篇文章，均利用各類光敏材料如GelMA、CS-AEMA或HAMA，混合海藻酸鈉和源自骨髓的人體間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC）配置成生物墨水，并利用同軸打印技術(shù)，實(shí)現(xiàn)墨水中海藻酸鈉在噴嘴處的同步交聯(lián)，以構(gòu)建具有極高的形態(tài)保真度、細(xì)胞存活率和機(jī)械性能的軟骨組織結(jié)構(gòu)，是用于軟骨修復(fù)的又一有力工具。

Costantini, Marco, Joanna Idaszek, Krisztina Szöke, JakubJaroszewicz, Mariella Dentini, Andrea Barbetta, Jan E. Brinchmann, and WojciechŚwięszkowski."3D bioprinting of BM-MSCs-loaded ECM biomimetic hydrogels for in vitroneocartilage formation." Biofabrication 8, no. 3 (2016): 035002.

肌肉組織

體積性肌肉缺損（VML）是指肌肉出現(xiàn)20%不可逆的缺損，現(xiàn)有技術(shù)利用水凝膠和脫細(xì)胞基質(zhì)（dECM）構(gòu)建三維肌肉組織用于VML的修復(fù)，但是療效仍有局限性。韓國(guó)浦項(xiàng)科技大學(xué)的Dong-Woo Cho課題組于Biomaterials發(fā)表研究成果，將dECM制備成生物墨水，通過(guò)同軸噴頭將其打印在基于明膠顆粒的懸浮膠中，使其形成外部是血管內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)部是肌肉細(xì)胞的復(fù)雜肌肉組織。實(shí)驗(yàn)證明這種肌肉組織具有良好的細(xì)胞活性，并增強(qiáng)新生肌肉形成能力，而這種復(fù)合結(jié)構(gòu)更可以有效的幫助細(xì)胞分化和血管化的形成，并提供更好的功能修復(fù)，可以有效的促進(jìn)VML的療效。

Choi, Yeong-Jin, Young-Joon Jun, Dong Yeon Kim,Hee-Gyeong Yi, Su-Hun Chae, Junsu Kang, Juyong Lee et al. "A 3D cellprinted muscle construct with tissue-derived bioink for the treatment ofvolumetric muscle loss." Biomaterials 206 (2019): 160-169.

血管組織

構(gòu)建復(fù)雜且具有功能性的人造血管組織結(jié)構(gòu)仍然是組織工程的一大難點(diǎn)。生物3D打印技術(shù)可以有效的構(gòu)建三維血管網(wǎng)絡(luò)，以促進(jìn)氧氣，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢物的運(yùn)輸。美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院于Biomaterials發(fā)表研究，提出了一種可以構(gòu)建可灌注血管結(jié)構(gòu)的工藝方法。研究團(tuán)隊(duì)將光敏材料GelMA、PEGTA與海藻酸鈉混合制成生物墨水，通過(guò)多層同軸噴頭進(jìn)行打印，實(shí)現(xiàn)墨水中海藻酸鈉在噴嘴處的同步交聯(lián)，并直接形成管狀結(jié)構(gòu)，后續(xù)通過(guò)進(jìn)一步光固化和海藻酸鈉洗脫，最終形成可灌注血管結(jié)構(gòu)。這樣的復(fù)合材料具有良好的生物學(xué)性能，有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和干細(xì)胞在結(jié)構(gòu)中的擴(kuò)散和增值。這種新技術(shù)可以高效構(gòu)建大尺寸血管化組織的構(gòu)建，并在未來(lái)中應(yīng)用于器官移植和修復(fù)。

Jia, Weitao, P. Selcan Gungor-Ozkerim, Yu ShrikeZhang, Kan Yue, Kai Zhu, Wanjun Liu, Qingment Pi et al. "Direct 3Dbioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink."Biomaterials 106 (2016): 58-68.

細(xì)胞免疫研究

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），其固有的抑制功能是免疫系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)劑。離體擴(kuò)增Treg的系統(tǒng)性過(guò)繼轉(zhuǎn)移已經(jīng)被廣泛研究用于異體移植。由于目前Treg的擴(kuò)增方法耗時(shí)且昂貴，來(lái)自澳大利亞阿德萊德大學(xué)的Patrick Toby Coates課題組于Advanced Functional Materials雜志發(fā)表一項(xiàng)研究，該研究首次報(bào)道了用于天然免疫抑制的人天然和誘導(dǎo)的Treg的水凝膠包裹培養(yǎng)。該研究將鼠胰島與人天然和誘導(dǎo)的Tregs同軸打印，打印體在與人外周血單核細(xì)胞共培養(yǎng)后，保護(hù)胰島免受異種反應(yīng)。這種通過(guò)同軸3D生物打印建立了Treg的共包裹培養(yǎng)，是為同種異體細(xì)胞移植（例如胰島）提供局部免疫保護(hù)的有效選擇。

Kim, J., Hope, C. M., Gantumur, N., Perkins, G.B., Stead, S. O., Yue, Z., … Coates, P. T. (2020). Encapsulation of HumanNatural and Induced Regulatory T‐Cells in IL‐2 and CCL1 SupplementedAlginate‐GelMA Hydrogel for 3D Bioprinting. Advanced Functional Materials,2000544.

未來(lái)展望

隨著技術(shù)水平的不斷進(jìn)步，同軸噴頭系統(tǒng)也將取得進(jìn)一步的拓展和豐富。

目前，已經(jīng)有研究者實(shí)現(xiàn)具有多層次套管組織的打印，多材料的復(fù)合使用是同軸噴頭技術(shù)的下一步方向。UCLA的AliKhademhosseini教授團(tuán)隊(duì)，就使用同軸噴頭打印了含有多層細(xì)胞套管的管腔結(jié)構(gòu)。

Pi, Q.,Maharjan, S., Yan, X., Liu, X., Singh, B., van Genderen, A. M.,Robledo‐Padilla, F., Parra‐Saldivar, R., Hu, N., Jia, W., Xu, C., Kang, J.,Hassan, S., Cheng, H., Hou, X., Khademhosseini, A., Zhang, Y. S., Adv. Mater.2018, 30, 1706913.

通過(guò)技術(shù)疊加，同軸噴頭還可以打印具有梯度濃度的結(jié)構(gòu)體。波蘭華沙工業(yè)大學(xué)的Wojciech Święszkowski課題組通過(guò)微流控技術(shù)與同軸噴頭復(fù)合系統(tǒng)進(jìn)行打印，不僅實(shí)現(xiàn)墨水中海藻酸鈉在噴嘴處的同步交聯(lián)，還實(shí)現(xiàn)了透明軟骨與鈣化軟骨的分層結(jié)構(gòu)。

Idaszek, Joanna, Marco Costantini, Tommy A.Karlsen, Jakub Jaroszewicz, Cristina Colosi, Stefano Testa, Ersilia Fornetti etal. "3D bioprinting of hydrogel constructs with cell and materialgradients for the regeneration of full-thickness chondral defect using amicrofluidic printing head." Biofabrication 11, no. 4 (2019): 044101.