點(diǎn)突變大小鼠在體內(nèi)體外臨床研究的應(yīng)用

點(diǎn)突變與人類疾病

基因是很多生命的藍(lán)圖，基因突變雖有對(duì)物種的多樣性和演化有重要的作用，但同時(shí)也是很多疾病的根源。點(diǎn)突變就是突變類型中最常見(jiàn)的一種，是色盲癥、鐮刀狀細(xì)胞貧血癥、囊性纖維化以及很多腫瘤病變中的罪魁禍?zhǔn)�。除了引發(fā)癌癥以外，一些點(diǎn)突變還能提高癌細(xì)胞的藥物抗性，因此針對(duì)同一靶點(diǎn)有時(shí)需要設(shè)計(jì)不同的藥物才能取得一致的療效。

圖1. 點(diǎn)突變與人類疾病。圖中突變的位點(diǎn)為數(shù)字表示，數(shù)字前的字母為正常氨基酸簡(jiǎn)稱，數(shù)字后的字母為突變后的氨基酸簡(jiǎn)稱，如果數(shù)字后沒(méi)有字母，則表示存在多種突變形式。

 

點(diǎn)突變是突變的一種，廣義的點(diǎn)突變包括所有單個(gè)堿基的改變，即缺失、插入和替換。而狹義的點(diǎn)突變則僅指單個(gè)堿基的替換。嘌呤之間和嘧啶之間的替換叫做轉(zhuǎn)換，而嘧啶與嘌呤之間的替換則叫顛換。以上說(shuō)的都是DNA分子層面的改變，如果把視角擴(kuò)展到染色體的層面，則存在染色體數(shù)量改變和染色體結(jié)構(gòu)變異兩種。

圖2. 點(diǎn)突變的方式。

 

點(diǎn)突變對(duì)氨基酸及其構(gòu)成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響分為三種，即同義突變、無(wú)義突變和錯(cuò)義突變。一般情況下，在相同的位點(diǎn)，無(wú)義突變對(duì)蛋白質(zhì)影響最大，錯(cuò)義突變的非保守型突變次之，接下來(lái)是錯(cuò)義突變中的保守型突變，同義突變本身對(duì)蛋白質(zhì)功能無(wú)影響。

圖3. 點(diǎn)突變對(duì)氨基酸的影響。

 

圖4. 點(diǎn)突變是發(fā)生概率最高的突變方式。

 

據(jù)人類基因組突變數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，單堿基無(wú)義和錯(cuò)義突變占人類突變總數(shù)的65%以上，這里沒(méi)有將同義突變納入統(tǒng)計(jì)范疇。圖中的小片段指堿基數(shù)≤20的改變，大片段則是指堿基數(shù)＞20。

 

研究點(diǎn)突變疾病的利器——點(diǎn)突變模式動(dòng)物

依靠同源重組，可以將含有突變堿基的DNA片段整合到基因組中，但過(guò)低的重組效率以及種屬局限限制了點(diǎn)突變的研究。隨著各種核酸酶技術(shù)在2009-2013年之間井噴式的發(fā)展及以后的不斷完善，尤其是Crispr/Cas9技術(shù)的發(fā)明，使得基因編輯的效率大幅提高，難度和成本也顯著降低，其在點(diǎn)突變疾病研究中發(fā)揮著重要作用。

 

在目前的臨床前研究中，傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因和基因敲除動(dòng)物仍然占有相當(dāng)比重。但是，人類疾病中基因產(chǎn)物并非總是如轉(zhuǎn)基因一樣的高表達(dá)，也不是像基因敲除動(dòng)物一樣完全不表達(dá)。很多情況下只是由于單個(gè)或者少數(shù)幾個(gè)堿基的改變而造成的蛋白結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為非正常激活或者抑制。因此，構(gòu)建精細(xì)的與疾病對(duì)應(yīng)的點(diǎn)突變動(dòng)物模型便成為了疾病臨床前研究的最佳方案。而現(xiàn)在的Crispr/Cas9技術(shù)也使得我們能夠以更低的成本和功能高的效率將之實(shí)現(xiàn)。賽業(yè)生物紅鼠庫(kù)通過(guò)對(duì)上千例Crispr項(xiàng)目進(jìn)行深度學(xué)習(xí)，綜合gRNA切割位點(diǎn)、點(diǎn)突變位置、oligo長(zhǎng)度、同義突變個(gè)數(shù)、所在位點(diǎn)Cas9切割效率以及脫靶率等因素，智能化生成gRNA設(shè)計(jì)方案。

 

此外針對(duì)通常條件下，細(xì)胞偏向于使用非同源末端連接的方式對(duì)斷裂的雙鏈進(jìn)行修復(fù)，進(jìn)而造成靶位點(diǎn)基因的插入/缺失突變。賽業(yè)生物團(tuán)隊(duì)在 Crispr/Cas9 技術(shù)的基礎(chǔ)上創(chuàng)新性研發(fā)出 CRISPR-Pro 基因修飾技術(shù)，采用獨(dú)特的受精卵處理方式讓受精卵偏好同源重組修復(fù)路徑，進(jìn)而提高同源重組效率。

圖5. 賽業(yè)助您構(gòu)建點(diǎn)突變模式動(dòng)物。

 

模式動(dòng)物的基因與人類往往存在幾個(gè)堿基的差異，比如目前主流觀點(diǎn)中造成AD的元兇Aβ序列，小鼠與人類之間存在3個(gè)堿基的差異，而家族性AD中除了需要人源化Aβ以外，還需要將Aβ前體APP的致病堿基進(jìn)行突變。此外，針對(duì)兩個(gè)距離接近的突變位點(diǎn)和距離遠(yuǎn)的突變位點(diǎn)，也需要采用不同的打靶策略。賽業(yè)生物就不同的距離點(diǎn)突變動(dòng)物的構(gòu)建已經(jīng)形成了一套成熟的體系，以最少的步驟構(gòu)建出您所需要的動(dòng)物，節(jié)省寶貴的研發(fā)時(shí)間。

圖6. 點(diǎn)突變小鼠數(shù)據(jù)庫(kù)及定制平臺(tái)。

 

賽業(yè)點(diǎn)突變模型成功案例節(jié)選

使用賽業(yè)點(diǎn)突變數(shù)據(jù)庫(kù)可以高效智能地設(shè)計(jì)雙gRNA切割。以阿爾茨海默病致病基因APP為例，可以通過(guò)賽業(yè)的點(diǎn)突變小鼠數(shù)據(jù)庫(kù)獲取該基因編碼蛋白的不同類型，根據(jù)氨基酸位點(diǎn)設(shè)計(jì)點(diǎn)突變方案，經(jīng)過(guò)深度學(xué)習(xí)的系統(tǒng)會(huì)根據(jù)gRNA切割位點(diǎn)。按照?qǐng)D中步驟設(shè)置即可完成設(shè)計(jì)。

圖7. 點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)。

 

基于我們的研究目的，我們將APP基因進(jìn)行Aβ片段的人源化改造（改造三個(gè)位點(diǎn)），并引入文獻(xiàn)中報(bào)道能抑制Aβ產(chǎn)生的A673T突變，用以在動(dòng)物模型中研究這個(gè)位點(diǎn)突變的功能。

圖8. 點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)。

 

基于上述系統(tǒng)，賽業(yè)已成功開(kāi)發(fā)多種多點(diǎn)突變動(dòng)物，尤其是我們以大鼠為對(duì)象構(gòu)建的阿爾茨海默病相關(guān)模型，其文獻(xiàn)已經(jīng)發(fā)表。

圖9. 賽業(yè)生物已完成多位點(diǎn)突變項(xiàng)目及發(fā)表文獻(xiàn)。

 

作為基因改變相關(guān)疾病最主要的誘因，針對(duì)點(diǎn)突變的研究不論是在先天的遺傳疾病還是后天突變導(dǎo)致的腫瘤中都具有重要的意義。要在動(dòng)物身上研究人類疾病，除了致病突變以外，對(duì)蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)的人源化也是藥物評(píng)價(jià)中不可或缺的，因此高效的多點(diǎn)突變模式動(dòng)物會(huì)有更多的應(yīng)用場(chǎng)景，我們也將不斷探索，更快更好地為客戶您提供優(yōu)質(zhì)的點(diǎn)突變模型。