CRISPR-Cas9技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用

   

 

CRISPR的前世今生

1987年，日本科學(xué)家在研究大腸桿菌的時(shí)候發(fā)現(xiàn)其基因組上存在一些看起來“奇怪”的重復(fù)結(jié)構(gòu)：有一段29堿基的序列反復(fù)出現(xiàn)了5次，且兩兩之間被32個(gè)堿基形成的序列隔開了！但這個(gè)發(fā)現(xiàn)在當(dāng)時(shí)并沒有引起科學(xué)界的很大關(guān)注，畢竟在自然界的生物體內(nèi)，各種奇奇怪怪的發(fā)現(xiàn)實(shí)在太多。然后僅僅幾年后，1993年西班牙科學(xué)家弗朗西斯科莫西卡在另外一種細(xì)菌——地中海噬鹽菌中又一次發(fā)現(xiàn)了這種奇特的重復(fù)序列，這引起了莫西卡的興趣，于是莫西卡在其他細(xì)菌中繼續(xù)尋找，到2000年，莫西卡竟然在超過20種不同微生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)這種重復(fù)DNA結(jié)構(gòu)，從此這種重復(fù)序列就有了其學(xué)術(shù)大名：成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered Regulation Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）。

 

對(duì)于任何有機(jī)生命體來說，保存、復(fù)制和傳遞遺傳物質(zhì)都是一件非常精細(xì)、困難也很占用資源的事情，因此在這么多不同的物種中都保留了這么一長串的CRISPR序列，必定有其重要的用處。隨后，科學(xué)家通過對(duì)比多種細(xì)菌的幾千段CRIPSR序列后發(fā)現(xiàn)，在CRIPSR序列中存在許多片段與病毒的基因組序列高度一致，雖然不是完整的病毒基因組序列，但這些序列被夾在一段細(xì)菌精心設(shè)計(jì)的重復(fù)序列中，進(jìn)一步的研究證實(shí)，這些與病毒基因組高度一致的序列來自于“噬菌體”——一類可以感染和侵襲細(xì)菌的病毒，這不禁讓人聯(lián)想到細(xì)菌會(huì)不會(huì)是靠對(duì)CRISPR序列的“記憶”來發(fā)揮其對(duì)噬菌體的免疫。2007年，一群在杜邦公司旗下的丹尼斯克食品配料公司工作的科學(xué)家在嗜熱鏈球菌中證明了CRISPR序列對(duì)于細(xì)菌免疫系統(tǒng)的功能，自此，CRISPR技術(shù)才開始走進(jìn)科學(xué)家的視野。

 

2013年，Jennifer Doudna、哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的George Church和麻省理工大學(xué)博德研究所的張鋒分別帶領(lǐng)3個(gè)研究團(tuán)隊(duì)相繼證明了CRISPR序列與Cas9蛋白結(jié)合可以在人類細(xì)胞中高效地定位、剪切和修改基因組。2014年，美國專利與商標(biāo)局將CRISPR-Cas9技術(shù)相關(guān)的第一個(gè)專利授予給張鋒所在的博德研究所，并將張鋒作為專利的第一發(fā)明人，這也開啟了張鋒和Jennifer Doudna漫長的專利之爭。2019年，張鋒團(tuán)隊(duì)在Nature communications發(fā)表論文，稱開發(fā)了第三種基因編輯工具CRISPR-Cas12b，并能在哺乳動(dòng)物和人體中進(jìn)行有效的基因編輯，同年8月，瑞士蘇黎世聯(lián)邦理工學(xué)院（ETH）的研究團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)細(xì)胞內(nèi)25個(gè)基因靶點(diǎn)進(jìn)行編輯，為CRISPR-Cas技術(shù)帶來了革命性突破。

 

認(rèn)識(shí)CRISPR-Cas9

基因編輯技術(shù)是對(duì)細(xì)胞中的DNA序列進(jìn)行精準(zhǔn)操作從而改變細(xì)胞命運(yùn)和生物體特征的技術(shù)，該技術(shù)為提高人類對(duì)于遺傳學(xué)的理解以及遺傳疾病的治療提供了重要的工具。CRISPR/Cas9系統(tǒng)主要由Cas9蛋白和單鏈向?qū)�RNA（sgRNA）所組成，其中Cas9蛋白起切割DNA雙鏈的作用，sgRNA起向?qū)У淖饔�，在sgRNA的向?qū)�下通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則Cas9蛋白可對(duì)不同的靶部位進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)DNA的雙鏈斷裂（如下圖）。CRISPR-Cas9是繼鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)核酸酶（TALEN）之后出現(xiàn)的第3代基因編輯技術(shù)，與ZFNs和TALENs的Fok I酶只有在二聚化才具有切割活性不同的是，Cas9在sgRNA的引導(dǎo)下以單體蛋白的形式就可發(fā)揮功能，從而避免了復(fù)雜的蛋白設(shè)計(jì)或組裝的需要。CRISPR-Cas9的編輯效率和精確性相比于ZFN和TALEN有了顯著提高，其應(yīng)用領(lǐng)域也開始從遺傳性疾病擴(kuò)展到更多復(fù)雜的疾病，目前，CRISPR-Cas9技術(shù)已經(jīng)被用于操縱培養(yǎng)細(xì)胞和原代細(xì)胞、編輯動(dòng)物和植物的基因組，極大地加快了基礎(chǔ)研究的步伐。

 

 

CRISPR系統(tǒng)要實(shí)現(xiàn)sgRNA和Cas9蛋白的遞送，通常可從DNA水平、RNA水平和蛋白水平進(jìn)行遞送，即遞送含編碼Cas9蛋白和sgRNA的質(zhì)粒、遞送sgRNA和編碼Csa9蛋白的mRNA，直接遞送sgRNA和Cas9蛋白。其中從DNA水平遞送編碼Cas9蛋白和sgRNA質(zhì)粒的方式有病毒法、電轉(zhuǎn)法和脂質(zhì)體法，其中病毒法具有操作簡單、成本低和穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，是目前較為常用的一種方式，但也存在脫靶率較高和基因整合的風(fēng)險(xiǎn)。而從RNA水平的遞送則是將編碼Cas9蛋白的mRNA和sgRNA遞送到細(xì)胞質(zhì)，在核糖體的作用下翻譯成蛋白質(zhì)，由于mRNA在體內(nèi)或體外均容易降解，此方式需要采用合適的方法保護(hù)mRNA不受降解。而遞送Cas9蛋白和sgRNA則最為直接簡便，由于不用經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，使得編輯過程更加快速高效，且脫靶率更低，但此方法的難點(diǎn)在于遞送載體的選擇和構(gòu)建，開發(fā)新型載體如脂質(zhì)體、金納米顆粒、陽離子聚合物等對(duì)于此方法的廣泛應(yīng)用十分重要。

 

 

病毒載體和蛋白-RNA復(fù)合物電穿孔是目前CRISPR常見的兩種遞送方式，其中體外研究較受歡迎的運(yùn)輸方式是將Cas9組裝進(jìn)蛋白-RNA（核糖蛋白復(fù)合物，RNP）復(fù)合物然后使用電穿孔進(jìn)行運(yùn)輸，而體內(nèi)運(yùn)輸釋放過程具有更大的挑戰(zhàn)性，一般會(huì)采用病毒載體進(jìn)行運(yùn)輸。病毒載體包括慢病毒（LV）、腺病毒（AdV）以及腺相關(guān)病毒（AAV），相比于其他載體，病毒載體在運(yùn)輸效率以及組織特異性方面具有很大優(yōu)勢。近幾年，由于AAV載體特有的優(yōu)勢，如具有組織特異性以及較低的免疫原性，使其在應(yīng)用于基因治療產(chǎn)品開發(fā)上表現(xiàn)出了極大的潛力。電穿孔法則是體外細(xì)胞基因編輯元件運(yùn)輸?shù)闹饕�方式，通過高壓電流脈沖細(xì)胞，在細(xì)胞膜上產(chǎn)生瞬間的納米級(jí)孔隙，從而允許RNP進(jìn)入細(xì)胞，幾乎所有類型的細(xì)胞，一旦確定了電穿孔條件，都可以實(shí)現(xiàn)較高效率的瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，但高壓脈沖引起大量細(xì)胞死亡和僅部分成功的膜修復(fù)，與化學(xué)轉(zhuǎn)染方法相比需要使用更大量的細(xì)胞。

 

CRISPR-Cas9在腫瘤研究中的應(yīng)用

目前CRISPR-Cas9技術(shù)主要用于細(xì)胞和動(dòng)物水平的模型建立，而在腫瘤研究領(lǐng)域，已有多種基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞和動(dòng)物模型被成功建立，并用于腫瘤基因、藥物靶點(diǎn)和耐藥性等方面的臨床前驗(yàn)證。

 

1. 在體內(nèi)動(dòng)物模型的應(yīng)用

癌癥動(dòng)物模型的建立是研究癌癥相關(guān)基因功能的一個(gè)重要手段，CRISPR/Cas9技術(shù)極大地簡化了癌癥動(dòng)物模型的建立，降低了成本又加快了建模周期。目前，采用CRISPR/Cas9建立的腫瘤動(dòng)物模型最常用的為小鼠，其次為大鼠、豬等。例如張峰團(tuán)隊(duì)通過CRISPR/Cas9技術(shù)成功地構(gòu)建了小鼠肝癌和肺癌模型，他們首先利用Cre-loxP系統(tǒng)將Cas9基因敲入小鼠體內(nèi)，構(gòu)建Cas9小鼠模型后，將篩選出來的3個(gè)基因：KRAS、p53和LKB1基因的sgRNA分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，模型鼠發(fā)展出了肉眼可見的肺腺癌病理表征，從而證明了KRAS、p53和LKB1基因在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用[1]。賽業(yè)生物采用基于傳統(tǒng)CRISPR/Cas9升級(jí)而成的CRISPR-Pro技術(shù)已經(jīng)為數(shù)千位科研人員成功構(gòu)建了腫瘤研究相關(guān)的基因編輯小鼠和大鼠模型，且研究成果在Nature Communication、Leukemia等頂尖期刊發(fā)表。

 

2. 在體外細(xì)胞模型的應(yīng)用

對(duì)于發(fā)病機(jī)制并不明確的癌癥，通過CRISPR/Cas9技術(shù)可研究特定基因在腫瘤發(fā)生和進(jìn)展過程中的作用。目前采用CRISP/Cas9技術(shù)建立的腫瘤模型有肺癌、乳腺癌和急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系等，例如有研究者采用CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)沉默骨肉瘤細(xì)胞系KHOS和U-2OS中CDK11基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CDK11基因沉默后骨肉瘤增殖和侵襲能力顯著減弱[2]。慢性髓系白血病的發(fā)生常與體內(nèi)抑癌基因ASXL1的突變有關(guān)，并且影響患者的預(yù)后。另外有研究者利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向修復(fù)了KBM5細(xì)胞中ASXL1的無效突變，顯著降低了KBM5細(xì)胞的增殖速率，增強(qiáng)了細(xì)胞的分化，并且經(jīng)過ASXL1基因修復(fù)的荷瘤小鼠的生存時(shí)間較未經(jīng)ASXL1修復(fù)的荷瘤小鼠生存時(shí)間長。另外，劍橋大學(xué)等多個(gè)研究機(jī)構(gòu)的科研人員對(duì)來自30種不同惡性腫瘤的324種腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行了基因組規(guī)模的CRISPR/Cas9篩選，發(fā)開了名為Project Score的數(shù)據(jù)庫，從而為尋找腫瘤的作用靶點(diǎn)提供幫助。賽業(yè)生物提供的細(xì)胞基因編輯服務(wù)已經(jīng)在198種腫瘤細(xì)胞上成功構(gòu)建了基因敲除、基因敲入的細(xì)胞模型，例如采用CRISPR-Pro技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞基因敲除可實(shí)現(xiàn)大片段的基因敲除，相比于常規(guī)的移碼突變敲除得更加徹底。

 

CRISPR/Cas9技術(shù)在未來腫瘤研究及治療方面的發(fā)展?jié)摿κ菬o限的，但是我們必須清醒地認(rèn)識(shí)到，這項(xiàng)技術(shù)還存在很多尚未解決的問題，比如脫靶效應(yīng)，應(yīng)用于人體時(shí)的倫理問題、安全性問題等。但可以預(yù)見的是，隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷創(chuàng)新最終會(huì)解決上述難題，為腫瘤的治療研究提供新的思路和方向，為腫瘤患者帶去新希望。

 

賽業(yè)生物長期致力于大小鼠基因編輯和細(xì)胞基因編輯領(lǐng)域，擁有經(jīng)驗(yàn)豐富的專家團(tuán)隊(duì)和成熟穩(wěn)定的技術(shù)平臺(tái)。

 

細(xì)胞基因編輯平臺(tái)：

細(xì)胞基因編輯基于傳統(tǒng)CRISPR/Cas9升級(jí)而成的CRISPR-Pro技術(shù)，采用電轉(zhuǎn)方式進(jìn)行轉(zhuǎn)染，雙gRNA同時(shí)打靶，可實(shí)現(xiàn)更徹底的大片段基因敲除、基因敲入和精準(zhǔn)點(diǎn)突變，與移碼突變相比，敲除更徹底，各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明采用CRISPR-Pro技術(shù)更高效。

 

動(dòng)物基因編輯平臺(tái)：

除了CRISPR-Pro技術(shù)以外，賽業(yè)生物模式動(dòng)物一站式服務(wù)平臺(tái)還有alphaknockout基因打靶專家系統(tǒng)、ES打靶技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了模型建立的高效、穩(wěn)定和數(shù)據(jù)可靠性，提供的動(dòng)物基因編輯服務(wù)涵蓋了藥篩評(píng)價(jià)小鼠模型、定制動(dòng)物模型、定制模型下游服務(wù)和無菌鼠技術(shù)平臺(tái)等，可以滿足大部分客戶的科研需求。