超級多模式基因電轉(zhuǎn)化儀在疫苗研發(fā)方向的應用
摘要
目前，某些病原體擴散迅速且變異率高，但疫苗的研發(fā)與生產(chǎn)有時候跟不上速度，不能更快更準的控制病原體的侵襲與擴散，隨之帶來的嚴重后果不敢想象。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的疫苗種類去緩解這狀況。RNA疫苗一直倍受歡迎, 源于其安全，生產(chǎn)無需細胞，可以快速對病原體產(chǎn)生免疫反應。
目前有兩種RNA疫苗種類：
1． 合成mRNA，其僅編碼目標抗原。
2． 自擴增RNA（sa-RNA），是病毒衍生的RNA，編碼目標抗原和使RNA疫苗復制的蛋白質(zhì)。
目前為止的研究表明：兩種疫苗類型均可誘導免疫反應，但并未明確哪種方法是最佳的。因此，本研究比較了一下合成mRNA和sa-RNA表達的流感病病毒血凝素。發(fā)現(xiàn)兩種RNA都有保護性。但同等的保護水平，sa-RNA 僅需要1.25 mg，而mRNA 需要80 mg，足足節(jié)省了64倍的原料。確定sa-RNA比mRNA更有效后，又以sa-RNA作為疫苗測試了三株流感病毒，分別為H1N1，H3N2（X31）和B（馬薩諸塞州）毒株，并且發(fā)現(xiàn)sa-RNA都能保護目標免受感染。當sa-RNA制成三價制劑，可以防止H1N1和H3N2病毒侵染。由此我們得出結(jié)論：sa-RNA更具美好前景的抗病毒疫苗。
背景介紹
流感病毒是一種具有大流行潛力的病原體，屬于正粘病毒科，可分為3種型：A，B和C型流感。由于它們的RNA基因組是分段的，因此有許多亞型，尤其是在A型流感病毒中。發(fā)生不同病毒亞型的突變和重組相當容易導致新菌株的頻繁出現(xiàn)。在人類中，流感病毒在20世紀引起了3次大流行。2009年最新的“豬流感”大流行被認為是低致病性毒株，但仍然感染了約2億人，并造成了201,200人死亡。目前，大多數(shù)流感疫苗是由滅活疫苗制備的病毒，生長在有胚的雞蛋中，但這對于禽類病毒，可能對雞胚有高致病性。從這方面來說，RNA疫苗更有效率。mRNA已用于免疫小鼠，雪貂和豬，獲得其流感疫苗。2013年，sa-RNA已用于防治H1N1和新興的H7N9亞型流感病毒。
因為病原體序列數(shù)據(jù)采集的速度較快，所以核酸疫苗是較有前景的疫苗種類。此外，與滅活或減毒病毒相比，核酸是不變的基本產(chǎn)物，所需的監(jiān)管測試更少。目前已經(jīng)提出了兩種核酸疫苗種類用于疫苗接種，即RNA和DNA。相對來說，RNA是較好的，因為與DNA疫苗（必須克服兩個轉(zhuǎn)錄障礙，即細胞膜和核膜）不同，RNA疫苗一旦進入細胞質(zhì)就可以將其轉(zhuǎn)化為抗原，這不但提高了轉(zhuǎn)染效率，而且使免疫應答具有連鎖反應。RNA疫苗快速與安全，生產(chǎn)過程無需細胞，且能誘導B細胞和T細胞反應，優(yōu)點明顯。雖然合成mRNA可立即翻譯抗原，有良好的抗病毒保護作用，但其合成需要大量的mRNA原料。從小型動物所需的材料擴大到人類，可能會在出現(xiàn)流行病時限制疫苗的使用。因此，需要對該方法進行進一步的研究。
BEX CUY21 EDIT II在此研究中的作用
最新款的CUY21 EDIT II 采用最先進的脈沖芯片控制技術，BEX獨有的多步脈沖，反向脈沖及恒流脈沖轉(zhuǎn)化模式，無需任何專用試劑，提供高效高存活率的轉(zhuǎn)化。
本研究中，為了驗證DNA疫苗是否可預防H1N1流感，所以對BALB/c小鼠進行DNA疫苗電轉(zhuǎn)注射，采用150v穿孔電壓，5個正負交替極性脈沖。
結(jié)果
1.少劑量的sa-RNA即可與mRNA等效。
A/B：用120，80，20ug H1N1/PR8 HA-mRNA 及5ug滅活病毒（def-Virus）和乳酸林格緩沖液對BALB/c小鼠進行肌肉注射，三周后再進行一次增強免疫。然后通過HAI（A）和VNT（B）對其體內(nèi)H1N1特異性抗體進行檢測。
C/D：BALB/c小鼠通過鼻內(nèi)感染10倍劑量的H1N1/PR8 HA-mRNA，其生存率（C）與體重變化（D）。
E/F：用1.25，0.25，0.05ug H1N1/PR8 HA-SaRNA 及5ug滅活病毒（def-Virus）和乳酸林格緩沖液對BALB/c小鼠進行肌肉注射，三周后再進行一次增強。然后通過HAI（E）和VNT（F）對其體內(nèi)H1N1特異性抗體進行檢測。
G/H：BALB/c小鼠通過鼻內(nèi)感染10倍劑量的H1N1/PR8 HA-SaRNA，其生存率（C）與體重變化（D）。
2.Sa-RNA與mRNA應答反應的對比
3.與mRNA相比，sa-RNA可以表達更多抗原。
A：BALB/c小鼠通過肌肉注射4ug（每條腿2ug）帶有螢光素酶基因的Sa-RNA和mRNA。在接種后的各個時間點進行腹膜內(nèi)注射D-熒光素，使用IVIS光譜體內(nèi)成像系統(tǒng)觀察表達情況。每個時間點選擇一張代表性圖像。
B：來自n = 6只動物的熒光素酶水平情況，點代表平均值±SEM。
4.sa-RNA的效率可以通過改變其運輸方式進而提升，如聚乙烯亞胺運輸方式（PEI-based）。
A/B：BALB-c小鼠分別用PEI-Sa RNA和僅Sa-RNA在第一天與第21天注射。在第19天（A）與54天（B）收集血清。
A-F：BALB-c小鼠肌肉注射1.5ug和0.5ug Cal‘09 H1N1 HA-Sa RNA。
G-I：BALB-c小鼠肌肉注射1.5ug和0.5ug B-Mass H1N1 HA-Sa RNA。
J-L：BALB-c小鼠肌肉注射1.5ug和0.5ug X31 H3N2 H1N1 HA-Sa RNA。免疫應答反應結(jié)果與1.5ug HIV Sa-RNA（陰性對照），蛋白質(zhì)疫苗和無進行免疫的小鼠作對比。
A：接種疫苗后測量H1N1特異性IgG。
B：小鼠鼻內(nèi)感染了Cal’09 H1N1病毒后的體重變化。
C：測量肺中H1N1 流感M基因拷貝數(shù)。
D/E：H1N1特異性IgG與特異性IgG2a/IgG1的測量情況。
F：肺中特異性H1 CD8+T細胞在感染后第7天的測量情況。
G：對于B-Mass，特異性IgG用ELISA方法檢測。
H：小鼠鼻內(nèi)感染了B/Florida/06病毒后的體重變化。
I：流感病毒B NS基因肺中的拷貝數(shù)測量情況。
J：H3N2特異性Ig ELISA測量情況。
K：小鼠鼻內(nèi)感染了X31 H3N2病毒后的體重變化。
L：測量肺中流感X31 H3N2 M基因拷貝數(shù)。
6.與單一HA相比，結(jié)合三種HA的sa-RNA（三價Sa-RNA）不會降低對H1NI 和H3N2的抵抗作用。
A-C：BALB/c小鼠肌肉分別注射1.5ug Cal’09 H1N1，B-Mass和X31 H3N2 Sa-RNA（三價Sa-RNA），僅1.5ug Cal’09 H1N1和1.8ug流感病毒蛋白疫苗，三周后進行一次增強免疫。
A：特異性H1N1 IgG抗體的ELISA檢測情況。
B：特異性H3N2 IgG抗體的ELISA檢測情況。
C：特異性B IgG抗體的ELISA檢測情況。
D：在第7周，小鼠感染Cal’09 H1N1流感病毒，并且每天監(jiān)測體重變化結(jié)果。
E：7天后，三價Sa-RNA實驗組與僅Cal’09 H1N1實驗組感染X31 H3N2流感病毒后體重變化結(jié)果。
7.單劑量的sa-RNA或DNA疫苗可預防H1N1流感
A：BALB/c小鼠肌肉注射1.5ug Cal’09 H1N1 DNA或Sa-RNA疫苗。RNA注射是帶運輸方式的形式，DNA注射是帶運輸方式的形式或僅DNA形式，通過肌肉電轉(zhuǎn)注射。4周后，感染Cal‘09 H1N1流感病毒，對其體重情況進行測量。
B：感染后7天，測量肺中M基因拷貝數(shù)。
C：感染后4天，特異性H1N1 IgG 測量。
D：特異性IgG2a/IgG1的測量情況。
E：感染后7天，通過五聚體染色法在肺組織中測量流感病毒特異性CD8 + T細胞的比例。
結(jié)論
本研究比較合成mRNA和sa-RNA表達的流感病病毒血凝素。發(fā)現(xiàn)兩種RNA都有保護性的。但同等的保護水平，sa-RNA 僅需要1.25 mg，而mRNA 需要80 mg，足足節(jié)省了64倍的原料。確定sa-RNA比mRNA更有效后，本實驗以sa-RNA作為疫苗測試了三株流感病毒，分別為H1N1，H3N2（X31）和B（馬薩諸塞州）毒株，并且發(fā)現(xiàn)sa-RNA都能保護目標免受感染。當sa-RNA制成三價制劑，可以防止H1N1和H3N2病毒侵染。由此我們得出結(jié)論：sa-RNA是有美好前景的抗病毒疫苗。
參考文獻
PMID: 29275847
PMCID: PMC5835025
DOI: 10.1016/j.ymthe.2017.11.017
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