小鼠模型在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

小鼠模型已經(jīng)成為研究基因功能與致病機(jī)制、建立人相關(guān)疾病模型和評價(jià)研發(fā)藥物安全性與有效性等生物醫(yī)藥研究不可取代的模式動(dòng)物。轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究就是針對來自臨床患者實(shí)際問題，通過實(shí)驗(yàn)室包括分子、細(xì)胞及模式動(dòng)物的相關(guān)基礎(chǔ)及臨床前研究，最終實(shí)現(xiàn)解決臨床所面臨的已知與未知的難題。所以，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究解決問題的思路與策略，就是將臨床問題，通過實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究與臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究相結(jié)合，再將研究成果最終轉(zhuǎn)化到臨床實(shí)際應(yīng)用的過程。

 

如何應(yīng)用小鼠模型發(fā)高質(zhì)量文章？

應(yīng)用小鼠模型開展臨床前相關(guān)研究，是實(shí)現(xiàn)基礎(chǔ)研究轉(zhuǎn)化至臨床應(yīng)用的重要橋梁，而要想建立如此至關(guān)重要的連接橋梁，構(gòu)建人源化小鼠模型是臨床前研究必不可少的強(qiáng)有力工具。過去的研究實(shí)踐告訴我們，要想發(fā)高質(zhì)量水平的文章，理想的研究策略就是通過從臨床實(shí)踐中尋找與發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)生相關(guān)的潛在新基因，構(gòu)建相應(yīng)的基因編輯小鼠模型，以研究證實(shí)潛在疾病相關(guān)基因與人疾病的因果關(guān)系及其致病相關(guān)機(jī)制，從而為建立人相關(guān)疾病小鼠模型奠定基礎(chǔ)，也為評價(jià)人相關(guān)疾病的臨床治療藥物及方法的臨床前研究創(chuàng)造了條件。

 

再此，我通過分享我們客戶今年發(fā)表于國際著名期刊《Circulation》上的高分文章《In Vivo AAV-CRISPR/Cas9-mediated Gene Editing Ameliorates Atherosclerosis in Familial Hypercholesterolemia》成功案例，進(jìn)一步說明如何應(yīng)用基因編輯小鼠模型，開展相關(guān)基因與疾病相互關(guān)系，以及如何通過該基因編輯小鼠模型，評估基因治療疾病有效性等方面的研究思路策略與技術(shù)方法。

 

1.家族性高膽固醇血癥小鼠疾病模型的建立

文章作者首先從家族性高膽固醇血糖臨床純合子患者中（表現(xiàn)為血漿中高膽固醇和低密度脂蛋白升高，以及血?jiǎng)用}粥樣硬化等表型），篩查到低密度脂蛋白受體（LDLR）未知新突變（比如E207X），且在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，表達(dá)突變LDLR基因與其功能改變具有相關(guān)性。那么，如何證實(shí)該新發(fā)現(xiàn)的點(diǎn)突變與家族性高膽固醇血癥與動(dòng)脈粥樣硬化的因果關(guān)系？作者明白，只依賴體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果是很難具有真正說服力的，因此，作者計(jì)劃在小鼠體內(nèi)復(fù)制人LDLR-E207X點(diǎn)突變，以研究該基因新突變與疾病發(fā)生的關(guān)系。作者找到我們賽業(yè)生物尋求幫助，構(gòu)建LDLR-E207X點(diǎn)突變小鼠模型。我們通過比對人LDLR與小鼠Ldlr基因序列，找到對應(yīng)人LDLR E207X點(diǎn)突變位于小鼠Ldlr的E208X位置，應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的gRNA系列及供體DNA，通過顯微原核注射方法，成功構(gòu)建Ldlr-E208X點(diǎn)突變小鼠模型。研究結(jié)果表明，因?yàn)樵擖c(diǎn)突變引入終止密碼，導(dǎo)致小鼠Ldlr蛋白表達(dá)功能缺失，且該小鼠模型在高脂飲食誘導(dǎo)下出現(xiàn)明顯高膽固醇血癥及動(dòng)脈粥樣硬化表型。通過構(gòu)建Ldlr-E208X點(diǎn)突變小鼠模型，作者不僅證實(shí)了Ldlr-E208X點(diǎn)突變與臨床患者高膽固醇血癥及動(dòng)脈粥樣硬化間的因果關(guān)系，而且也建立該疾病的小鼠模型。

 

2.AAV-CRISPR/Cas9基因治療

在此小鼠模型基礎(chǔ)上，作者進(jìn)一步探索基因修正療法治療該疾病的可能性與效果。應(yīng)用肝特異性血清型AAV8載體介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因治療技術(shù)，通過分別構(gòu)建肝特異性表達(dá)AAV8-Cas9和AAV8-gRNA加正常Ldlr供體的表達(dá)載體，采用皮下注射方法治療剛剛出生的Ldlr-E208X點(diǎn)突變小鼠，結(jié)果證實(shí)，經(jīng)AAV8-CRISPR/Cas9基因治療后，小鼠體內(nèi)正常Ldlr蛋白表達(dá)出現(xiàn)一定程度恢復(fù)，且小鼠的高膽固醇血癥及動(dòng)脈粥樣硬化表型也都獲得一定程度的改善，表明AAV8-CRISPR/Cas9體內(nèi)Ldlr修復(fù)治療具有一定效果。作者通過從臨床患者中發(fā)現(xiàn)可能的新致病基因，到構(gòu)建點(diǎn)突變小鼠模型，證實(shí)該基因點(diǎn)突變與疾病的因果關(guān)系，再到證明AAV8-CRISPR/Cas9基因治療，可以緩解疾病表型的驗(yàn)證，并最終提出了該疾病發(fā)生機(jī)制與治療假說，即因LDLR E207X點(diǎn)突變，使該基因功能損傷，導(dǎo)致血中LDL含量增加，從而引起高膽固醇血癥及動(dòng)脈粥樣硬化表型。而借助AAV8-CRISPR/Cas9表達(dá)載體修正肝臟LDLR基因功能，具有較低血中LDL作用，從而發(fā)揮緩解高膽固醇血癥及動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用。

 

該文章無論從研究思路與策略，再到技術(shù)方法，都為我們今后應(yīng)用基因編輯小鼠模型，開展相關(guān)基因功能研究，疾病模型的建立，以及治療方法及其效果評價(jià)提供了非常好的參考借鑒作用。

 

為什么要構(gòu)建人源化小鼠模型？人源化小鼠模型有哪幾種類型？

過去人們提起人源化小鼠模型，首先想到是應(yīng)用免疫缺陷小鼠，移植人細(xì)胞或組織，使小鼠體內(nèi)含人免疫系統(tǒng)的人源化小鼠模型。然而，現(xiàn)在的人源化小鼠模型概念已擴(kuò)展到包括，應(yīng)用基因編輯技術(shù)，導(dǎo)入人相關(guān)基因，或者應(yīng)用無菌小鼠，移植人腸道微生物等方法實(shí)現(xiàn)。所以，所謂人源化小鼠模型，就是指通過移植或基因編輯技術(shù)方法，將人細(xì)胞組織、人基因或人腸道微生物導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，構(gòu)建的使小鼠體內(nèi)含有人相關(guān)細(xì)胞或組織、基因或腸道微生物等類型的小鼠模型。

 

為什么要構(gòu)建人源化小鼠模型？由于人與小鼠作為不同物種，在遺傳學(xué)、解剖學(xué)、生理病理及代謝等方面雖然有相似性，但也自然有許多不同，特別是其免疫系統(tǒng)存在明顯差異，從而也限制了某些人致病病原體致病機(jī)制及抗感染/腫瘤微環(huán)境的相互作用等領(lǐng)域的研究，比如HIV病毒、登革熱病毒、肝炎病毒、冠狀病毒等感染人體病毒，小鼠卻完全或非常不易感。通過將人源細(xì)胞移植至免疫缺陷小鼠體內(nèi)，構(gòu)建人源化免疫系統(tǒng)小鼠模型，使這類小鼠模型成為感染人病毒的易感模式動(dòng)物，有助于建立人病毒病原體感染研究的小鼠模型。將腫瘤患者腫瘤組織移植免疫缺陷小鼠建立的PDX小鼠模型，也已成為當(dāng)前臨床腫瘤精準(zhǔn)治療的重要策略與技術(shù)方法，然而，如何真實(shí)反映與評價(jià)人源免疫細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境在抗腫瘤免疫治療中發(fā)揮的作用，則需要建立更加有效的人免疫反應(yīng)體系小鼠模型。比如，CAR-T和免疫檢測點(diǎn)抑制劑的抗腫瘤作用是離不開相關(guān)免疫細(xì)胞的參與，因此，構(gòu)建含人源免疫細(xì)胞系統(tǒng)的人源化小鼠模型，在有效驗(yàn)證與評估抗腫瘤免疫治療作用中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

 

近年來，抗CTLA-4和抗PD-1抗體作為免疫檢測點(diǎn)（ICP）抑制劑臨床抗腫瘤免疫治療的成功，讓人們看到了此類人源治療性抗體研發(fā)的巨大發(fā)展前景。由于抗ICP人源抗體是針對人靶點(diǎn)，因此，如果計(jì)劃應(yīng)用小鼠模型，對抗ICP人源抗體的安全性與有效性進(jìn)行臨床前體內(nèi)驗(yàn)證與評估，則需要借助基因編輯技術(shù)，比如CRISPR/Cas9或TurboKnockout（賽業(yè)生物建立的改良版ES打靶）技術(shù)，對小鼠相關(guān)抗體靶點(diǎn)基因進(jìn)行人源化修飾，建立基因編輯的人源化ICP小鼠模型。目前我們也提供相關(guān)ICP人源化商品鼠，包括hCTLA-4、hPD-1、hGITR、hVISTA、hOX40、hCD28和hCD39等。

 

另外，人體腸道微生物組已被認(rèn)為是人體超級生物體的組成部分，是維持人體生態(tài)平衡重要器官之一。近來來，關(guān)于腸-腦軸和腸-肝軸概念的提出，已越來越說明，人腸道微生物組成不同及多樣性，直接或間接影響到人體健康及疾病發(fā)生發(fā)展，以及藥物治療疾病作用。通過移植人腸道微生物組至無菌小鼠，構(gòu)建人源化腸道微生物的小鼠模型，無疑有助于研究腸道微生物與疾病發(fā)生的因果關(guān)系、致病機(jī)制、藥物治療影響特殊微生物群等相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。

 

BRGSF新型免疫缺陷小鼠特征及其優(yōu)勢？

通過移植人細(xì)胞/組織至免疫缺陷小鼠方法，在小鼠體內(nèi)重建人源免疫系統(tǒng)，被人們傳統(tǒng)意義上，最早稱之為人源化小鼠模型，而免疫缺陷小鼠則是該類人源化小鼠模型構(gòu)建的基礎(chǔ)。上世紀(jì)60年代初，免疫缺陷小鼠由早期的T細(xì)胞缺陷的裸鼠開始、經(jīng)歷了T細(xì)胞和B細(xì)胞缺陷的SCID小鼠，T細(xì)胞、B細(xì)胞和部分先天免疫細(xì)胞缺陷的NOD-SCID小鼠，發(fā)展到在NOD-SCID遺傳背景基礎(chǔ)上，通過敲除IL-2rg受體，分別構(gòu)建了更為嚴(yán)重免疫缺陷（T/B/NK細(xì)胞缺陷）的NOG（2002年）和NSG （2005年）小鼠的重要里程碑階段。另外，在BALB/c遺傳背景小鼠基礎(chǔ)上，通過敲除Rag2和IL-2rg受體，構(gòu)建與NOG/NSG免疫缺陷相似的BRG小鼠（2005年）。

 

近年來，為了提高人源髓系細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的移植效率，人們又在NOG/NSG小鼠基礎(chǔ)上，引入有利于人源髓系細(xì)胞發(fā)育成熟的人相關(guān)細(xì)胞因子，比如GM-CSF、IL-3和SCF等，分別構(gòu)建了NOG-EXL和NSG-SGM3的改良型免疫缺陷小鼠。雖然，作為NOG/NSG構(gòu)建基礎(chǔ)的NOD-SCID小鼠，利用了NOD小鼠先天免疫部分缺陷與Sirpa基因變異特征，有利于人源細(xì)胞移植的優(yōu)勢，但NOD-SCID遺傳背景小鼠也存在明顯的先天不足，比如NOD背景小鼠中補(bǔ)體5基因功能損失，導(dǎo)致無法實(shí)現(xiàn)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒殺傷作用（CDC）；而SCID背景小鼠又表現(xiàn)對放射性敏感性增加的特性，使其對某些基因毒性藥物更加敏感，并容易發(fā)生自發(fā)性腫瘤形成的現(xiàn)象。另外，由于NOG-EXL和NSG-SGM3改良型免疫缺陷小鼠引入過表達(dá)的人相關(guān)細(xì)胞因子，使該類免疫缺陷小鼠移植人源細(xì)胞后，容易引起小鼠貧血現(xiàn)象，從而縮短了人源化小鼠模型的使用窗口期（一般也只有3～7個(gè)月時(shí)間）。

 

BRG免疫缺陷小鼠是基于BALB/c遺傳背景的小鼠，由于其Sirpa基因無法與人單核/巨噬細(xì)胞表面的CD47結(jié)合，形成“do-not-eat me”現(xiàn)象，因而不利于提高人源細(xì)胞移植效率。然而，由于BRG小鼠是直接通過敲除Rag2基因，實(shí)現(xiàn)小鼠T/B細(xì)胞功能缺陷，從而克服了SCID基因破壞引起的不足。而通過成功引入NOD-Sirpa至BRG遺傳背景的小鼠上，建立的BRGS小鼠，克服了原先BRG 小鼠的不足，大大增加了其移植人源細(xì)胞的效率。且在BRGS小鼠基礎(chǔ)上，敲除髓系細(xì)胞發(fā)育成熟相關(guān)的小鼠Flt3基因，成功構(gòu)建的BRGSF新型免疫缺陷小鼠（2017年）更顯示其獨(dú)特的優(yōu)勢。

 

與目前同類NOG-EXL和NSG-SGM2改良型免疫缺陷小鼠比較，在人源細(xì)胞（比如人CD34+造血干細(xì)胞）移植效率方面，特別是人髓系細(xì)胞（比如DC細(xì)胞），以及人源細(xì)胞在小鼠體內(nèi)有效存活時(shí)間等方面，BRGSF新型免疫缺陷小鼠都表現(xiàn)有明顯提高，再加上BRGSF小鼠無補(bǔ)體5及SCID基因的缺失，確保了該免疫缺陷小鼠作為有效評價(jià)CDC作用相關(guān)策略臨床前研究的可能性。另外，因?yàn)闆]有采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入人相關(guān)細(xì)胞因子（如GM-CSF和IL-3等），也避免由此可能引起的移植小鼠出現(xiàn)貧血現(xiàn)象，使重建的人源免疫系統(tǒng)在BRGSF小鼠體內(nèi)至少可以維持一年以上，大大提高了人源化小鼠模型的使用效率。

 

BRGSF小鼠模型是抗體藥物研發(fā)、疫苗開發(fā)、嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞療法的功效和安全性以及髓系發(fā)育研究的寶貴工具。此外，由于在BRGSF植入人造血細(xì)胞效率極高，因此它是制備免疫系統(tǒng)人源化（HIS）小鼠以研究和預(yù)測人類體內(nèi)免疫反應(yīng)的最佳模型。目前，我們賽業(yè)生物可為科研與醫(yī)藥研發(fā)等相關(guān)研究領(lǐng)域提供該種BRGSF免疫缺陷小鼠產(chǎn)品及相關(guān)技術(shù)服務(wù)。我們相信，BRGSF新型免疫缺陷小鼠的成功構(gòu)建，將會極大促進(jìn)人源化小鼠模型在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用。

 

俞曉峰博士 賽業(yè)生物高級科學(xué)家

國際知名模式動(dòng)物和細(xì)胞生物學(xué)專家。1995年于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士畢業(yè)后，先后就任于耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院、iTL基因打靶公司（作為資深科學(xué)家負(fù)責(zé)基因工程小鼠模型研發(fā)方案與策略設(shè)計(jì)）和紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院。2010-2013年期間擔(dān)任美國ASC生物技術(shù)公司研發(fā)部總監(jiān)、服務(wù)部總監(jiān)以及斯坦福生物技術(shù)公司副總裁等職務(wù)。目前任職于賽業(yè)生物科技，主要負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)基因鼠及基因敲除鼠平臺的技術(shù)工作，其研究成果多次發(fā)表在Nature Immunology、Mol Cell Biol等高水平雜志上。