如何利用新型固定床生物反應(yīng)器開(kāi)發(fā)高產(chǎn)量活病毒疫苗生產(chǎn)平臺(tái)

​摘要：病毒疫苗生產(chǎn)日益增加的重要性，推動(dòng)了細(xì)胞高密度培養(yǎng)生產(chǎn)工藝的發(fā)展。傳統(tǒng)的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)工藝有一定的物理局限性，如較大的設(shè)備占地、時(shí)間和較多的勞動(dòng)力。我們通過(guò)新型一次性scale-Xcarbo生物反應(yīng)器建立的病毒疫苗生產(chǎn)系統(tǒng)，解決了這種限制。該單元結(jié)構(gòu)緊湊，且可規(guī)模放大，并且可實(shí)現(xiàn)與生物感應(yīng)器罐連接進(jìn)行連續(xù)的下游純化及濃縮工藝。Vero細(xì)胞是病毒疫苗生產(chǎn)中使用最多的貼壁細(xì)胞系之一。本文中使用Vero細(xì)胞專利細(xì)胞系進(jìn)行含拉沙熱病毒糖蛋白的活性重組水泡口炎病毒疫苗生產(chǎn)。本文中，進(jìn)行了代謝物分析，并比較了傳統(tǒng)搖瓶、細(xì)胞工廠以及scale-Xcarbo生物反應(yīng)器的病毒產(chǎn)量。相比傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶的2.67x10⁶ pfu/cm²以及細(xì)胞工廠的5.77x10⁸pfu/cm²，一次性使用生物反應(yīng)器單位面積可生產(chǎn)高2-4 log的滴度，約為5x10¹⁰ pfu/cm²。該新型生物反應(yīng)器平臺(tái)，可實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)高效和可規(guī)模放大的病毒疫苗生產(chǎn)。

1. 簡(jiǎn)介

一次性使用的固定床生物反應(yīng)器作為貼壁細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，可用于多種不同病毒載體、活病毒及基于病毒的疫苗的生產(chǎn)。此類生物反應(yīng)器將平底器皿系統(tǒng)的低剪切環(huán)境和自動(dòng)化及可放大性相結(jié)合。Pall的iCELLis^®和Eppendorf的Fibra-Cel^®系統(tǒng)已被用于病毒載體和活病毒的高產(chǎn)量生產(chǎn)。使用這種封閉式固定床生物反應(yīng)器具有顯著的優(yōu)勢(shì)，包括產(chǎn)品控制、較低的資源和材料需求、節(jié)省生產(chǎn)時(shí)間以及更低的單位劑量生產(chǎn)成本。最近上市的固定床產(chǎn)品是來(lái)自Univercells的scale-X 生物反應(yīng)器系統(tǒng)。scale-X產(chǎn)品線提供一系列的生長(zhǎng)表面積規(guī)格：scale-X hydro（<3m²）、carbo（10-30m²）、以及nitro（200-600m²）。該范圍可實(shí)現(xiàn)用于臨床批次生產(chǎn)的可放大工藝和產(chǎn)能。在Univercells產(chǎn)品線中，生物反應(yīng)器高度增加，而直徑保持恒定。例如，carbo 10m²生物反應(yīng)器高度為30m²生物反應(yīng)器的1/3。而不同產(chǎn)品線之間的規(guī)模放大通過(guò)保持固定床高度恒定而增加直徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，200m²生物反應(yīng)器與10m²生物反應(yīng)器具有相同的高度，但是直徑不同。

scale-X carbo系統(tǒng)為一次性使用生物反應(yīng)器，其偶聯(lián)了以實(shí)驗(yàn)室規(guī)模自動(dòng)化工藝控制器（pH、DO、T、攪拌、液體流速）操作的在線產(chǎn)物濃縮模塊，可實(shí)現(xiàn)病毒產(chǎn)物的生產(chǎn)及同步濃縮；這是將這種固定床生物反應(yīng)器與市面上其它產(chǎn)品區(qū)別開(kāi)來(lái)的新特點(diǎn)。scale-X carbo生物反應(yīng)器中的固定床可為細(xì)胞生長(zhǎng)提供10至30m2的表面積（生長(zhǎng)面積相當(dāng)于120-360個(gè)滾甁、59-175個(gè)HYPERFlasks^®、16-48個(gè)CellSTACK^®-10層或6-16個(gè)HYPERStack^®-36層罐），根據(jù)表面積規(guī)格，罐總體積為1.6-3.2L。這可有助于獲得更高的單位體積細(xì)胞密度以及緊湊的占地，從而整合在標(biāo)準(zhǔn)的生物安全柜內(nèi)。

大多數(shù)商品化固定床生物反應(yīng)器使用隨機(jī)裝填的圓盤(pán)或織物條，作為細(xì)胞貼附的底物；而scale-X生物反應(yīng)器使用以篩網(wǎng)層組織的固定床，其可為細(xì)胞生長(zhǎng)提供所需均勻性以及罐與罐之間的一致性。固定床由5cm2寬度的剛性聚丙烯篩網(wǎng)條帶和非編織親水性聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）織物交替螺旋管式組成，前者用于結(jié)構(gòu)定型和培養(yǎng)基流動(dòng)，后者用于細(xì)胞截留和貼附。這可實(shí)現(xiàn)均質(zhì)的徑向和垂直細(xì)胞分布以及通過(guò)篩網(wǎng)層的線性培養(yǎng)基流動(dòng)，確保均勻的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)。取樣端口安裝在生物反應(yīng)器頂蓋內(nèi)，可通過(guò)手動(dòng)操作，監(jiān)測(cè)培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞生長(zhǎng)。該功能為細(xì)胞計(jì)數(shù)樣品獲取提供了一個(gè)快速且便利的接入點(diǎn)，避免罐內(nèi)的交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)將受控的混合氣體供應(yīng)至生物反應(yīng)器的頂部空間（氧氣供應(yīng)、CO₂脫氣），并允許通過(guò)下降膜液氣界面吸收，實(shí)現(xiàn)環(huán)境控制，以支持細(xì)胞生長(zhǎng)。

該生物反應(yīng)器另一個(gè)與眾不同的特點(diǎn)是在線中空纖維過(guò)濾器的使用，其可在生產(chǎn)階段或收獲時(shí)濃縮生產(chǎn)的產(chǎn)物。含有病毒的培養(yǎng)基灌流出生物反應(yīng)器罐，進(jìn)入專門(mén)的“收獲”回流液容器中，而生物反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)基置換為新鮮的培養(yǎng)基。結(jié)果是可從生物反應(yīng)器獲得濃縮的小體積收獲原液，從而簡(jiǎn)化下游操作，并降低其尺寸。在本研究中，我們?cè)谑斋@瓶前增加了在線澄清過(guò)濾器，以降低對(duì)中空纖維過(guò)濾器的污染。該系統(tǒng)可在單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)尺寸的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行所有上游工藝和初步的下游工藝。

由于scale-X carbo生物反應(yīng)器舒適的人體工程學(xué)設(shè)計(jì)，我們選擇該系統(tǒng)用于開(kāi)發(fā)可放大的工藝，以生產(chǎn)基于重組水泡口炎病毒（rVSV）的拉沙病毒（LASV）疫苗。VSV是一種反義單鏈RNA病毒，可導(dǎo)致多種家畜的自限性疾病，且可感染人類，形成輕微的流感樣綜合征或保持無(wú)癥狀。VSV是一種有囊膜的子彈裝病毒，粒徑約70nm-200nm。較大的外源基因可包裝進(jìn)VSV并表達(dá)，使這種病毒成為理想的活病毒疫苗候選。此前，已經(jīng)有報(bào)導(dǎo)構(gòu)建了多種表達(dá)埃博拉病毒（EBOV）、馬爾堡病毒（MARV）和LASV糖蛋白的載體。但是，用于生產(chǎn)物料所需的規(guī)�？赡軙�(huì)是一個(gè)限制，特別是當(dāng)使用貼壁細(xì)胞作為生產(chǎn)細(xì)胞時(shí)。在本報(bào)告中，我們證實(shí)了使用Univercells的scale-X生物反應(yīng)器生產(chǎn)rVSV-LASV（VSVΔG/LASVGP）的工藝。與傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶生產(chǎn)工藝相比，使用scale-X carbo生物反應(yīng)器生產(chǎn)獲得的病毒產(chǎn)量可增加4-log。此外，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了代謝物數(shù)據(jù)；谷氨酰胺、氨、葡萄糖和乳酸趨勢(shì)均與病毒感染前生物反應(yīng)器中的正常細(xì)胞生長(zhǎng)一致。數(shù)據(jù)證實(shí)，相比傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶生產(chǎn)，scale-X carbo生物反應(yīng)器可獲得更高的單位面積病毒產(chǎn)量，這將顯著提升單次運(yùn)行可生產(chǎn)的劑量數(shù)�？偨Y(jié)來(lái)說(shuō)，我們介紹了一種有能力在低環(huán)境足跡條件下，進(jìn)行高產(chǎn)量病毒疫苗生產(chǎn)的新型可放大固定床生物反應(yīng)器系統(tǒng)。

2. 材料和方法

2.1. 固定床生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)

所有實(shí)驗(yàn)使用10m² scale-X Carbo生物反應(yīng)器（Univercells，Brussels，Belgium）和在線切向流過(guò)濾（TFF）組件（圖1）。生物反應(yīng)器以1.0-2.0x10⁴ cells/cm²的目標(biāo)接種密度接種（按生廠商說(shuō)明），細(xì)胞擴(kuò)增階段的工藝參數(shù)按生產(chǎn)商程序設(shè)置。培養(yǎng)參數(shù)確定為：溫度35至37℃，pH 7.0至7.6，攪拌設(shè)置為250RPM，工作體積1.6L。外置的加熱培養(yǎng)基循環(huán)回路連接至生物反應(yīng)器，以支持高細(xì)胞密度�；芈穬�(nèi)的培養(yǎng)基體積足夠大，以支持0.2-0.4mL/cm²的培養(yǎng)基與表面積比例。循環(huán)速度支持每天20-30個(gè)生物反應(yīng)器體積。除基礎(chǔ)補(bǔ)液管路為1/8”內(nèi)徑外，反應(yīng)器上的管路尺寸大于1/4”內(nèi)徑。

2.2. 細(xì)胞擴(kuò)增

Vero細(xì)胞系（Ology Bioservices Inc.）在專用無(wú)血清培養(yǎng)基（Ology Bioservices Inc.）中培養(yǎng)。細(xì)胞使用培養(yǎng)瓶和細(xì)胞工廠擴(kuò)增，接種密度為1.0-1.5x10⁴cells/mL。罐置于37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)。細(xì)胞傳代，直到達(dá)到約1.0-2.0x10⁹總活細(xì)胞量。收獲時(shí)，細(xì)胞單層用1X DPBS緩沖液（Gibco，Waltham，MA）漂洗，以去除過(guò)量的耗竭培養(yǎng)基，之后使用TrypLECTS Select（Gibco，Waltham，MA）解離。離心去除TrypLE，細(xì)胞重懸于新鮮培養(yǎng)基。在Vi-CELL XR 細(xì)胞活性分析器（Beckman Coulter，Brea，California）上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.3. 細(xì)胞密度和代謝物分析監(jiān)測(cè)

插在固定床內(nèi)的一次性使用采樣條每日取出，使用裂解緩沖液和細(xì)胞核計(jì)數(shù)，確定細(xì)胞密度。采樣條裂解5min，然后渦旋1min。細(xì)胞核用結(jié)晶紫染色，以觀察完整的細(xì)胞核。通過(guò)從無(wú)菌采樣端口提取培養(yǎng)基樣品，使用BioProfile®FLEX2（Nova Biomedical，Waltham，MA）每日檢測(cè)代謝物濃度。當(dāng)離線檢測(cè)偏離在線探針讀數(shù)>±0.05pH單位時(shí)，執(zhí)行pH偏移。

2.4. 感染過(guò)程

含有拉沙病毒（LASV）Josiah糖蛋白的重組水泡口炎病毒（rVSV）（去除糖蛋白G）（VSVΔG/LASVGP）由NIAID根據(jù)材料轉(zhuǎn)移協(xié)議（LAB-18-P_LV-22僅用于體外使用，且僅用于培訓(xùn)和研究目的）慷慨提供。滴度為4.9x10⁸ pfu/mL的VSVΔG/LASVGP原液用于所有生物反應(yīng)器感染研究。接種后5天或達(dá)到峰細(xì)胞密度（以谷氨酰胺檢測(cè)的氮源剝奪為準(zhǔn)）后，使用病毒接種液進(jìn)行生物反應(yīng)器感染。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，生物反應(yīng)器排干耗竭的培養(yǎng)基，然后灌滿含有病毒接種液的新鮮培養(yǎng)基。循環(huán)回路在感染時(shí)斷開(kāi)，以進(jìn)行批量模式感染。每個(gè)運(yùn)行以MOI 0.05的感染復(fù)數(shù)感染，感染過(guò)程進(jìn)行48至72h。一旦采樣條上的細(xì)胞計(jì)數(shù)耗盡，開(kāi)始收獲。培養(yǎng)瓶容器在與生物反應(yīng)器相同的時(shí)間，使用相同的病毒感染接種液，進(jìn)行感染。

圖1. scale-X carbo生物反應(yīng)器。scale-X carbo系統(tǒng)示意圖，30m²生物反應(yīng)器（紅色）位于生物反應(yīng)器控制臺(tái)中央。5L收獲瓶位于控制臺(tái)右手側(cè)，在線TFF組件位于收獲瓶后方。位于控制臺(tái)左手側(cè)的是控制面板，允許用戶啟動(dòng)或暫停生物反應(yīng)器泵。此外，接種液和基礎(chǔ)培養(yǎng)基瓶位于生物反應(yīng)器左側(cè)。在描述的實(shí)驗(yàn)中，使用10m²，即為30m²生物反應(yīng)器的1/3。外置循環(huán)回路未顯示。
 

2.5. 病毒收獲

收獲原液通過(guò)由Sartopure PP38μm過(guò)濾器和Sartopore 2 0.8/0.45μm過(guò)濾器組成的兩步深層過(guò)濾器鏈，收集進(jìn)入二級(jí)容器。在運(yùn)行4中，罐初步清空后，生物反應(yīng)器用額外的1L新鮮培養(yǎng)基潤(rùn)洗，以沖洗掉固定床中所有殘料的病毒顆粒。該沖洗液通過(guò)深層過(guò)濾器，以TFF步驟，進(jìn)行病毒濃縮。收獲原液使用100kD中空纖維TFF組件濃縮2倍。培養(yǎng)瓶容器在與生物反應(yīng)器相同的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行收獲，收獲原液以1000g離心10min澄清。

圖2. Carbo生物反應(yīng)器示意圖。突出顯示了以編織篩網(wǎng)基質(zhì)圍繞的雙層非編織篩網(wǎng)（藍(lán)色）。此外，顯示液流方向，以指示培養(yǎng)基在整個(gè)生物反應(yīng)器內(nèi)的流動(dòng)。用于在線pH和DO監(jiān)測(cè)的探針位于生物反應(yīng)器中央。

2.6. 噬斑分析

收獲原液取樣，以O(shè)logy Bioservices,INC.優(yōu)化的方法，通過(guò)噬斑分析定量，檢測(cè)病毒滴度。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，先生成10倍連續(xù)稀釋液，用結(jié)晶紫染色15min，漂洗，噬斑計(jì)數(shù)。

3. 結(jié)果

3.1. Scale-X carbo系統(tǒng)中的Vero細(xì)胞生長(zhǎng)

Scale-X carbo系統(tǒng)的獨(dú)特設(shè)計(jì)可允許液體在固定床內(nèi)流動(dòng)，并通過(guò)內(nèi)部集中通道回流到葉輪，形成連續(xù)的降膜機(jī)制（圖2）。降膜機(jī)制可在生物反應(yīng)器的覆蓋層內(nèi)實(shí)現(xiàn)氣體交換。使用生產(chǎn)商提供的指南和工藝參數(shù)，進(jìn)行了工藝建立運(yùn)行（運(yùn)行1）。該運(yùn)行確定Vero細(xì)胞系可在10m²固定床生物反應(yīng)器內(nèi)生長(zhǎng)至一致的細(xì)胞密度（表1）。隨后的運(yùn)行設(shè)計(jì)用于建立不同的操作條件，以達(dá)到最佳細(xì)胞密度（圖3）。如圖4所示，在所有的運(yùn)行中，從細(xì)胞接種（第0天）后的第1到5天，可觀察到均勻的細(xì)胞生長(zhǎng)。在運(yùn)行3中，允許細(xì)胞多生長(zhǎng)1天，以確定多出的1天是否可導(dǎo)致細(xì)胞顯著的生長(zhǎng)。結(jié)論是，等到第6天感染不會(huì)形成更高的細(xì)胞密度而獲得最大化的病毒生產(chǎn)。所以，推斷最佳細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)生在接種后第5天，即第5天可進(jìn)行Vero細(xì)胞病毒感染，以觸發(fā)進(jìn)一步的病毒生產(chǎn)。
 

3.2. 代謝物趨勢(shì)

在細(xì)胞生長(zhǎng)階段，檢測(cè)了主要代謝物的活性，包括谷氨酰胺和葡萄糖的消耗以及隨后的氨和乳酸的生產(chǎn)（圖4）。細(xì)胞接種時(shí)的谷氨酰胺濃度為2.4±0.2 mmol/L，并被消耗至低于分析的線性范圍。同樣的，接種時(shí)的葡萄糖濃度為17.57±1.27 mmol/L，并被消耗至低于分析的線性范圍。最高乳酸生產(chǎn)值為16.71mmol/L，最高氨離子濃度為2.77 mmol/L。

3.3. VSVΔG/LASVGP的生產(chǎn)

在第一個(gè)病毒生產(chǎn)運(yùn)行中（運(yùn)行1），接種后第5天，以MOI 0.05感染復(fù)數(shù)感染VSVΔG/LASVGP。感染后，可在生物反應(yīng)器內(nèi)的上清液中觀察到顯著的細(xì)胞碎片，感染后第2天，開(kāi)始病毒收獲。生物反應(yīng)器排液，以收獲含有病毒的上清液，進(jìn)行培養(yǎng)基潤(rùn)洗步驟，以從滯留體積中沖洗出所有殘留的病毒。VSVΔG/LASVGP收獲完成后，使用標(biāo)準(zhǔn)噬斑分析檢測(cè)病毒滴度。滴度計(jì)算為4.25x10¹² pfu/mL，對(duì)應(yīng)的總滴度為單次運(yùn)行6.80x10¹⁵pfu，標(biāo)準(zhǔn)化滴度為6.80x10¹⁰pfu/cm²（表2）。

圖3. 各個(gè)生物反應(yīng)器運(yùn)行的細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)。所示細(xì)胞計(jì)數(shù)至生物反應(yīng)器感染時(shí)間點(diǎn)。不同的運(yùn)行標(biāo)注如下：運(yùn)行1（▲）、運(yùn)行2（t）、運(yùn)行3（t）以及運(yùn)行4（l）。

圖4. 各個(gè)運(yùn)行中，10L carbo生物反應(yīng)器內(nèi)Vero細(xì)胞生長(zhǎng)的代謝物濃度趨勢(shì)。分析感染前，與細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的代謝物，谷氨酰胺（A）、氨（B）、葡萄糖（C）以及乳酸（D）。不同的運(yùn)行標(biāo)注如下：運(yùn)行1（▲）、運(yùn)行2（t）、運(yùn)行3（t）以及運(yùn)行4（l）。

運(yùn)行2和3的部分病毒生產(chǎn)參數(shù)與運(yùn)行1不同。首先，病毒收獲在感染后第3天開(kāi)始，其次，收獲原液通過(guò)2-步深層過(guò)濾鏈過(guò)濾，以去除過(guò)量的細(xì)胞碎片，然后收集到回流罐中。深層過(guò)濾器收獲后，有極少量的病毒被截留（數(shù)據(jù)未顯示），2個(gè)運(yùn)行的總體病毒產(chǎn)量與運(yùn)行1接近。運(yùn)行2和3原液中的平均病毒滴度分別為5.03x10^、¹² pfu/mL和2.90x10¹² pfu/mL，對(duì)應(yīng)的膜表面積標(biāo)準(zhǔn)化收獲滴度為7.55x10¹⁰ pfu/cm²和4.35x10¹⁰ pfu/cm²。兩個(gè)運(yùn)行以及前三個(gè)運(yùn)行之間，計(jì)算滴度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖5. 在線純化策略示意圖。Scale-X carbo生物反應(yīng)器連接至在線TFF組件和收獲容器。某些情況中，在收獲瓶前的生物反應(yīng)器流出管路上增加深層過(guò)濾器（未顯示），作為下游工藝部件。

最后一個(gè)運(yùn)行（運(yùn)行#4）使用在線切向流過(guò)濾（TFF）步驟，以在原液收獲并以深層過(guò)濾器澄清后，進(jìn)行病毒濃縮。在線TFF、生物反應(yīng)器以及回流容器的示意圖如圖5所示。所有細(xì)胞接種和感染參數(shù)按運(yùn)行2和3中執(zhí)行的程序進(jìn)行。但是，病毒原液收集后，上清液物料使用TFF進(jìn)行濃縮。TFF工藝在之前的運(yùn)行中沒(méi)有進(jìn)行。TFF步驟的加入可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行額外的漂洗，以收集可能位于生物反應(yīng)器固定床中的所有殘留病毒。病毒收獲液從1.6L濃縮至750mL，收獲原液的滴度計(jì)算為1.03x10¹²pfu/mL（表2）。TFF濃縮步驟完成后，回流液的滴度檢測(cè)為2.47x10¹²pfu/mL（表2）。該滴度對(duì)應(yīng)為濃縮2X，多出的病毒可能是漂洗后從固定床回收的病毒，也可能與噬斑分析本身的差異性有關(guān)。

最后，當(dāng)與使用T-225培養(yǎng)瓶或CELLSTACK-10進(jìn)行的生產(chǎn)進(jìn)行比較時(shí)，可發(fā)現(xiàn)使用scale-X生物反應(yīng)器可顯著提高病毒生產(chǎn)的量。每mL可增加超4 log對(duì)數(shù)的病毒，且與每個(gè)獨(dú)立生物反應(yīng)器運(yùn)行相關(guān)的參數(shù)無(wú)關(guān)，對(duì)比CELLSTACK-10和T-255生產(chǎn)，這相當(dāng)于單個(gè)生物反應(yīng)器可增加4-7 log對(duì)數(shù)的病毒�？傮w來(lái)看，scale-X carbo運(yùn)行的結(jié)果證實(shí)了使用這種生物反應(yīng)器是進(jìn)行活病毒生產(chǎn)、澄清和濃縮的有效方法。

4. 討論

一次性使用技術(shù)仍是生物制品生產(chǎn)的金標(biāo)準(zhǔn)，而其可放大性限制了貼壁細(xì)胞固定床生物反應(yīng)器系統(tǒng)的使用。scale-X生物反應(yīng)器產(chǎn)品線可從2.4m²臺(tái)式系統(tǒng)放大至600m²商品化規(guī)模系統(tǒng)。scale-X carbo生物反應(yīng)器已被證實(shí)是可克服其它固定床生物反應(yīng)器系統(tǒng)可放大性局限的有用工具。類似的系統(tǒng)沒(méi)有中間性表面積規(guī)模選擇，如10m2或30m²。而該規(guī)�？蔀槎喾N應(yīng)用提供所需物料，如臨床前毒理學(xué)研究批次、下游方法和分析方法的開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)對(duì)照物料以及臨床I期研究。其它固定床生物反應(yīng)器系統(tǒng)的一個(gè)限制是，當(dāng)放大到更大規(guī)模的固定床直徑時(shí)，產(chǎn)率會(huì)降低。scale-X carbo系列規(guī)模放大時(shí)增加固定床高度，而保持直徑恒定，從而降低了規(guī)模放大過(guò)程的影響。此外，此類生物反應(yīng)器的另一個(gè)與其它固定床生物反應(yīng)器相區(qū)別的獨(dú)特之處是固定床的基質(zhì)。固定床由5 cm²寬的非編織PET織物和聚丙烯篩網(wǎng)交替螺旋纏繞管式組成。PET織物提供用于細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)的三維微環(huán)境；聚丙烯篩網(wǎng)提供結(jié)構(gòu)和液流通道。固定床的螺旋設(shè)計(jì)結(jié)合生物反應(yīng)器高度的增加可實(shí)現(xiàn)生物反應(yīng)器內(nèi)均勻的徑向和垂直細(xì)胞分布，這可通過(guò)插入到固定床內(nèi)的PET織物采樣條進(jìn)行監(jiān)測(cè)，采樣條可通過(guò)生物反應(yīng)器系統(tǒng)頂蓋內(nèi)的取樣端口進(jìn)行采集PET樣條。八個(gè)取樣端口圍繞頂蓋均勻分布，其特征是具有一個(gè)鎖定端口系統(tǒng)，系統(tǒng)包括一個(gè)磁性連接至塑料桿的螺帽，而塑料桿連接至PET條。螺帽和塑料桿系統(tǒng)可從生物反應(yīng)器簡(jiǎn)單地取出，桿和帽的磁性可方便地將桿從帽上取下，并更換螺帽后放回端口，而維持無(wú)菌操作。然后可從桿上取下采樣條，PET條裂解細(xì)胞并細(xì)胞核計(jì)數(shù)后，用于確定單位面積的細(xì)胞數(shù)。取樣端口的位置和PET條在整個(gè)固定床內(nèi)的分布可用于確定細(xì)胞密度和分布。

此外，PET-聚丙烯篩網(wǎng)螺旋技術(shù)由于通過(guò)螺旋固定床聚丙烯篩網(wǎng)的培養(yǎng)基液流模式，可實(shí)現(xiàn)均勻的營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)（圖2）。培養(yǎng)基循環(huán)流速設(shè)置可達(dá)到每天約25個(gè)培養(yǎng)基體積置換。置換用于提供新鮮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并在毒性代謝物積聚前將其去除，結(jié)果表明，在生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞擴(kuò)增階段，可獲得一致的細(xì)胞生長(zhǎng)。如果細(xì)胞的代謝要求需要增加循環(huán)，可進(jìn)行更高的置換。

最后，該生物反應(yīng)器包括一個(gè)在線TFF中空纖維系統(tǒng)，可通過(guò)連續(xù)且無(wú)菌的方式，進(jìn)行病毒產(chǎn)物的純化和濃縮。為了緩和收獲過(guò)程中，生物反應(yīng)器液流中細(xì)胞碎片導(dǎo)致的中空纖維系統(tǒng)污染，可在流出生物反應(yīng)器的管路系統(tǒng)上焊接深層過(guò)濾器鏈，進(jìn)行澄清。這可在在線純化過(guò)程中，實(shí)現(xiàn)額外的澄清步驟，并捕獲細(xì)胞碎片。當(dāng)在生物反應(yīng)器內(nèi)增殖可裂解細(xì)胞的病毒并通過(guò)在線TFF系統(tǒng)純化病毒產(chǎn)物時(shí)，這是必不可少的。

本次研究的目的，首先是確定Vero細(xì)胞系在結(jié)合至生物反應(yīng)器PET織物床后是否可增殖，其次是比較在生物反應(yīng)器與傳統(tǒng)培養(yǎng)瓶中進(jìn)行的病毒疫苗首選物生產(chǎn)的結(jié)果。當(dāng)將細(xì)胞計(jì)數(shù)按相等表面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞密度高于T-225培養(yǎng)瓶或CellSTACK-10容器內(nèi)觀察到的最高細(xì)胞密度。這意味著，僅從更高的單位面積細(xì)胞數(shù)量，即可推測(cè)其可獲得更高的病毒產(chǎn)量，這還沒(méi)有考慮可能獲得更高病毒生產(chǎn)的細(xì)胞整體適應(yīng)性因素。此外，在生物反應(yīng)器內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)胞代謝物趨勢(shì)在4個(gè)運(yùn)行中保持一致，這表明了整體的細(xì)胞適應(yīng)性。對(duì)于病毒生產(chǎn)，由于使用的體積不一樣，很難根據(jù)容器和生物反應(yīng)器的體積來(lái)比較滴度。例如，T-225培養(yǎng)瓶的收獲體積約為60-65mL，CellSTACK-10和scale-X的收獲體積分別約為1.5L和1.8L。如表2所示，除了總收獲量外，滴度按單位體積報(bào)告。但是，為對(duì)生產(chǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化比較，滴度按單位面積報(bào)告。這可對(duì)不同容器和生物反應(yīng)器內(nèi)的病毒生產(chǎn)進(jìn)行更加全面的比較。平均來(lái)說(shuō)，T-225產(chǎn)量為2.67x10⁶pfu/cm²，而CellSTACK-10產(chǎn)量約為5.77x10⁸ pfu/cm²。4個(gè)獨(dú)立scale-Xcarbo運(yùn)行的平均滴度約為5.09x10¹⁰ pfu/cm²。按表面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，相比CellSTACK-10，scale-X carbo生物反應(yīng)器病毒產(chǎn)量約增加了2 log，而相比T-225，增加了4 log病毒。此外，scale-X carbo生產(chǎn)獲得的高滴度是使用約1.6L的小體積培養(yǎng)基獲得的。更小的體積可降低下游工藝中與澄清、純化和濃縮相關(guān)的復(fù)雜性。增加用于澄清的深層過(guò)濾器以及用于純化和濃縮的在線TFF，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)的無(wú)菌下游工藝，并將病毒產(chǎn)物收集在回流容器中。下游純化工藝通常會(huì)導(dǎo)致一定程度的病毒產(chǎn)物損失，但是，使用在線TFF中空纖維濃縮系統(tǒng)沒(méi)有導(dǎo)致病毒產(chǎn)物的損失。這可能是由于收獲過(guò)程中對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行了沖洗，從而回收了可能截留在固定床基質(zhì)中的殘留病毒，也可能是因?yàn)樵黾恿擞糜诩?xì)胞碎片澄清的深層過(guò)濾器以及過(guò)濾器孔徑的正確選擇。在線TFF可在病毒收獲后進(jìn)行漂洗步驟，以收集殘留的病毒，且由于TFF可實(shí)現(xiàn)2-3X的濃縮，所以抵消了漂洗增加的體積。最后，由于不同病毒的粒徑不同，所以需要根據(jù)粒徑來(lái)選擇正確的過(guò)濾器，以避免純化過(guò)程中，由于過(guò)濾器而導(dǎo)致的病毒損失。

綜上所述，病毒疫苗生產(chǎn)的增加可能源于多方面的因素，但主要是單位面積細(xì)胞數(shù)的增加以及細(xì)胞的整體適應(yīng)性，這可能是由于PET纖維床的幾何結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞密度均一性、捕獲以及貼附性。最終，這些因素實(shí)現(xiàn)了在培養(yǎng)基流動(dòng)通過(guò)固定床聚丙烯篩網(wǎng)層時(shí)均勻的營(yíng)養(yǎng)物供應(yīng)。該系統(tǒng)解決了疫苗低成本、高產(chǎn)量生產(chǎn)的關(guān)鍵需求，標(biāo)志著向活病毒疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)又邁進(jìn)了一步。最后，單位面積滴度的增加可提高單次運(yùn)行可生產(chǎn)的劑量數(shù)。

原文翻譯：D.M.Berrie, R.C.Waters, C.Montoya, et al., Development of a high-yield live-virus vaccine production platform using a novel fixed-bed bioreactor. Vaccine, 2020, 38:3639-3654.

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