如何將病毒載體生產(chǎn)從塑料器皿向固定床生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)變

來自Univercells的概念驗(yàn)證研究 – 可放大的HEK293細(xì)胞生長和腺病毒生產(chǎn)

早期到晚期臨床開發(fā)中的基因和修飾細(xì)胞治療（例如，嵌合抗原受體[CAR] T-細(xì)胞治療）在多種疾病的治療以及潛在治愈方面顯示出了良好的前景。這類新一代藥物中的多個(gè)產(chǎn)品已經(jīng)獲得了審批并開始進(jìn)入市場(chǎng)。

盡管有大量候選藥物的管線開始進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，但其仍面臨著可能的生產(chǎn)瓶頸 – 病毒載體生產(chǎn) – 其可能延遲產(chǎn)品的商業(yè)化進(jìn)程。

與使用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的大多數(shù)基于工程蛋白質(zhì)的生物制品不同的是，病毒載體的生產(chǎn)需要使用以基質(zhì)作為支持的貼壁細(xì)胞。目前，有兩種選擇可用于貼壁細(xì)胞生長：使用微載體或多層靜態(tài)式塑料器皿。

微載體懸浮在罐內(nèi)，并通過攪拌提供一個(gè)均質(zhì)的環(huán)境。但是，對(duì)于用于病毒載體生產(chǎn)的剪切敏感型細(xì)胞來說，攪拌會(huì)是一個(gè)極具挑戰(zhàn)的過程。由于反應(yīng)器內(nèi)流體動(dòng)力學(xué)狀態(tài)的變化，工藝規(guī)模放大也需要較多的工作。此外，這種工藝很難達(dá)到高細(xì)胞密度，而且規(guī)模放大需要使用大量昂貴的轉(zhuǎn)染試劑。

出于這些原因，傳統(tǒng)上會(huì)使用靜態(tài)的塑料器皿，進(jìn)行貼壁細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)染以及腺病毒載體的生產(chǎn)。但是，這種方法也有一定的局限性。首先，其不能實(shí)現(xiàn)精確的環(huán)境控制（pH、溶氧[DO]、培養(yǎng)基組成），需要大量的人工干預(yù)操作。此外，規(guī)模放大也很難實(shí)現(xiàn)，只能進(jìn)行規(guī)模擴(kuò)展。
 

一種可規(guī)模放大的解決方案

Univercells提供的可規(guī)模放大且自動(dòng)化的一次性使用固定床生物反應(yīng)器可解決這些技術(shù)難題，為制藥廠商提供了一個(gè)以可負(fù)擔(dān)的方式向市場(chǎng)提供所需數(shù)量產(chǎn)品的機(jī)會(huì)。生物反應(yīng)器的示意圖如圖1所示。

由螺旋卷式的非編織聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）織物層組成的緊密填充的支撐基質(zhì)，可在小體積生物反應(yīng)器內(nèi)實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度。位于生物反應(yīng)器內(nèi)的磁性離心葉輪具有兩種功能：良好的混勻，以確保營養(yǎng)物質(zhì)在整個(gè)固定床內(nèi)均勻的分布，以及通過在罐頂部空間形成“降膜”，以增加氣體交換的表面積，從而進(jìn)行通氣。培養(yǎng)基在細(xì)胞間溫和循環(huán)，提供類似于靜態(tài)塑料器皿中的條件，并保證在垂直和水平方向上均具有均勻的環(huán)境。

系統(tǒng)包括自動(dòng)pH、DO以及溫度控制；自動(dòng)接種及手動(dòng)培養(yǎng)基和細(xì)胞取樣；以及通過循環(huán)回路進(jìn)一步添加培養(yǎng)基的泵。

規(guī)�？s放通過增加固定直徑的高度（~10-、20-以及30-cm固定床高度）、然后平行增加直徑（10、20以及30cm）來實(shí)現(xiàn)。由于流動(dòng)通過固定床的液體培養(yǎng)基的線性流速在所有規(guī)模條件下保持恒定，所以細(xì)胞處于相似的低剪切狀態(tài)。系統(tǒng)的自動(dòng)化功能和簡(jiǎn)單的規(guī)模放大可實(shí)現(xiàn)病毒載體更快速的開發(fā)和商品化。
 

工藝轉(zhuǎn)換研究

通過使用相同的接種密度以及培養(yǎng)基比例體積，比較了在scale-X hydro 生物反應(yīng)器系統(tǒng)和標(biāo)準(zhǔn)塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行的工藝的性能，以研究將病毒載體生產(chǎn)從靜態(tài)塑料器皿轉(zhuǎn)換至固定床生物反應(yīng)器的簡(jiǎn)單性。

在scale-X hydro系統(tǒng)中進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)工藝包括5個(gè)步驟：（1）生物反應(yīng)器準(zhǔn)備，（2）接種和細(xì)胞黏附，（3）細(xì)胞擴(kuò)增，（4）病毒感染以及（5）收獲（圖2）。



實(shí)驗(yàn)使用來自凍存細(xì)胞庫（Momotaro-Gene）的HEK293細(xì)胞。接種液在標(biāo)準(zhǔn)條件下，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中制備。工藝過程中，監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度和病毒滴度（使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行目檢計(jì)數(shù)）和代謝物（葡萄糖、乳糖）濃度（離線代謝物分析儀）。

在所有工藝中，細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)連接一個(gè)外部的培養(yǎng)基源，接種后不久，開始通過生物反應(yīng)器進(jìn)行循環(huán)（圖2）。在第一個(gè)生物反應(yīng)器中（#1），培養(yǎng)基在第3天置換，以使細(xì)胞進(jìn)一步生長，但細(xì)胞不進(jìn)行感染。在生物反應(yīng)器#2和#3中，細(xì)胞擴(kuò)增以批次模式分別進(jìn)行2和3天，然后細(xì)胞感染。盡管細(xì)胞在感染后，會(huì)自然裂解，但仍使用去垢劑，以提高產(chǎn)物收率。

成功的細(xì)胞生長和感染

在相同條件下，固定床生物反應(yīng)器（#2和#3）中的細(xì)胞生長高于標(biāo)準(zhǔn)塑料器皿。（結(jié)果如圖3所示。）從圖中可見，固定床生物怒反應(yīng)器在第3天（2.1 x 10⁵ vs. 1.3 x 10⁵ cells/cm²）和第6天(6.5 x 10⁵ vs. 3.2 x 10⁵cells/cm²) 的性能優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)塑料器皿。注意，塑料器皿和生物反應(yīng)器使用相同的培養(yǎng)基置換比例，以在第6天達(dá)到高細(xì)胞密度。

所有生物反應(yīng)器均在接種后，使用4.2L 外置培養(yǎng)基循環(huán)回路進(jìn)行操作。在第3天，生物反應(yīng)器#1的外置培養(yǎng)基循環(huán)回路更換為新鮮培養(yǎng)基，從而使細(xì)胞進(jìn)一步生長至第6天。生物反應(yīng)器#2和#3以批次模式進(jìn)行操作，然后感染（分別在第2天和第3天進(jìn)行）。感染后細(xì)胞密度未顯示。生物反應(yīng)器#2的對(duì)照細(xì)胞密度未提供。

感染在達(dá)到目標(biāo)細(xì)胞密度條件時(shí)（生物反應(yīng)器#2和#3分別在第2天和第3天）進(jìn)行，觀察到所有細(xì)胞在感染后第3天裂解。使用相同的去垢劑處理，收獲每個(gè)工藝的產(chǎn)物。由于未進(jìn)行任何的工藝開發(fā)工作，所有生物反應(yīng)器內(nèi)的病毒滴度約比對(duì)照塑料器皿低1 log IRU。

通過工藝優(yōu)化進(jìn)一步提升的潛力

研究證實(shí)，基于靜態(tài)塑料器皿的產(chǎn)基因治療用腺病毒的HEK293工藝可成功轉(zhuǎn)換至Univercells scale-X生物反應(yīng)器系統(tǒng)。系統(tǒng)在小體積生物反應(yīng)器內(nèi)達(dá)到極高細(xì)胞密度和良好病毒產(chǎn)量的潛力，突出了系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高水平生產(chǎn)的能力，且設(shè)備占地大大降低，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化工藝步驟。

值得注意的是，在靜態(tài)塑料器皿和固定床生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行的工藝獲得了相似的結(jié)果，而生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行的工藝并未經(jīng)過太多的優(yōu)化工作。Scale-X hydro 生物反應(yīng)器內(nèi)獲得的更高的細(xì)胞密度很好的反映了系統(tǒng)內(nèi)更好的環(huán)境控制（pH和DO），這有利于實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的生產(chǎn)環(huán)境。結(jié)合非常有潛力的病毒產(chǎn)量結(jié)果，更高的細(xì)胞密度為進(jìn)一步的工藝開發(fā)打開了大門。

未來的工作將集中于關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPC）的確定，以優(yōu)化生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)條件，這在傳統(tǒng)靜態(tài)工藝中是無法實(shí)現(xiàn)的，因其缺乏工藝參數(shù)的控制，如pH和DO。

Scale-X™ hydro 系統(tǒng)是生物反應(yīng)器產(chǎn)品線的一部分，該產(chǎn)品線可用于生物工藝開發(fā)和中試規(guī)模培養(yǎng)（scale-X™ hydro 2.4 m² 和carbo 10-30 m²）、中到大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)（scale-X™ nitro， 200-600m²，一般適用于疫苗生產(chǎn)）以及更大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)（scale-X™ oxo， >2000m²，滿足基因治療需求）。已經(jīng)計(jì)劃了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)工藝向這些更大規(guī)模生物反應(yīng)器的可放大性。

原文翻譯：Y.Dohogne, F.Collignon, J,Drugmand, et al., Transferring Viral Vector Production from Plasticware to a Fixed-Bed Bioreactor. Genetic Engineering & Biotechnology News, 2019, 39 (2): 60-62.
 

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