scale-X™ 生物反應器在病毒載體生產中的應用
Vero 細胞均勻生長的應用筆記
摘要
scale-X 生物反應器是一種新型固定床系統(tǒng)，可用于貼壁和懸浮細胞系的培養(yǎng)。設備單元占地小，而具有相當大的表面積，從而可獲得極高細胞密度。本研究比較了在scale-X hydro生物反應器和標準微載體培養(yǎng)體系中進行的貼壁Vero細胞培養(yǎng)。兩種系統(tǒng)可獲得相似的單位面積細胞濃度。隨后，展開螺旋卷式固定床顯示，細胞在軸向和徑向上具有均勻的分布。這表明在生物反應器內部具有均勻的液體流動和細胞附著。觀察到的均質的細胞生長是一個重要的規(guī)模放大因素，以按可重復的方式，實現可用表面積最大限度的利用。
scale-X生物反應器簡介
大多數病毒疫苗的生產工藝基于貼壁細胞平臺。典型的培養(yǎng)系統(tǒng)，如滾瓶、多層細胞培養(yǎng)皿和微載體生物反應器，在規(guī)模放大時，都有一定的限制。為了克服潛在的規(guī)模放大限制，簡化生產，固定床生物反應器是一個極具價值的替代選擇。創(chuàng)新的scale-X生物反應器是一種可規(guī)模放大的固定床系統(tǒng)，可從研發(fā)（2.4 m2生長表面積）放大到中試（10和30m2生長表面積）和生產規(guī)模（200和600m2生長表面積；圖1）。scale-X專利技術使用了一種結構化的螺旋卷式非編織聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）固定床，以減少局部過度壓實和死區(qū)，同時實現可用內表面積及質量的最佳利用，獲得批次間的高可重復性（圖2）。
材料、方法 & 設備
固定床工藝：scale-X hydro生物反應器
細胞系和工藝條件
用于細胞密度和分布評估的方法
» 可從固定床提取12根整合的取樣條（每根1面積2.15 cm2）在1 mL細胞裂解緩沖液中充分混合3 min。消化的細胞核用結晶紫染色并進行計算。
» 當達到目標細胞密度后，取出固定床，小心地鋪開，剪下確定的1 cm2面積（圖3）。條帶上的細胞用試劑A100（ChemoMetec）裂解，并使用血細胞計數器對細胞核進行計數。
對照工藝：在攪拌罐生物反應器（STR）中進行Cytodex® 1微載體培養(yǎng)
細胞系和工藝條件
用于細胞密度和分布評估的方法
» 從生物反應器取5 mL樣品體積。進行三次的洗脫后，用0.1 M檸檬酸、0.1%結晶紫和0.1% Triton X-100溶液裂解細胞。
» 37℃孵育1小時后，用血細胞計數器對染色的細胞核進行計數。該方法詳細描述，參見Trabelsi et al.文章（Khaled Trabelsi, 2004）。
工藝參數（用于兩種培養(yǎng)）
» 添加4 mM谷氨酰胺的無血清培養(yǎng)基（VP-SFM， Gibco™）
» 補加葡萄糖和谷氨酰胺原液，以分別防止兩種底物低于8 mM和2 mM
» 使用CO2和 0.5 NaHCO3（微載體）或0.5 NaOH（scale-X）將pH值控制為7.2
» 溫度設定點為37℃
» 溶氧設定點為50%（頂部空間通氣）
VERO細胞生長
比較不同生物反應器系統(tǒng)內的最大Vero細胞密度（Kiesslich，2020）（圖4）：
scale-X hydro 生物反應器（2.4 m2）:2.7 x 105 cells/cm2
STR Cytodex® 1（0.75 m2）：2.4 x 105 cells/cm2
不同的細胞接種密度導致了不同但相當的生長曲線圖。scale-X生物反應器中的單位面積細胞密度（2.7x 105 cells/m2）略高于微載體培養(yǎng)（2.4 x 105 cells/m2）。兩種系統(tǒng)的培養(yǎng)基使用量接近，為2.1 - 2.2 ×109 cells/L培養(yǎng)基。當考慮兩個系統(tǒng)在同等產量下的反應器體積時，固定床生物反應器的設備占地顯著降低（降低5倍）。
圖4. 相比標準微載體培養(yǎng)，scale-X hydro生物反應器中的Vero細胞生長，由Kiesslich et al.（2020）提供。
Univercells進行了延長的Vero細胞生長研究（圖5）。在scale-X hydro生物反應器中進行了多次實驗（n=26），獲得了可重復的細胞密度，平均為2.5×105 cells/cm2。規(guī)模放大至更大的scale-X carbo生物反應器（10m2和30m2），可獲得相似的單位面積細胞密度。
圖5. Vero 細胞曲線圖：試驗以Vero 細胞生長在不同scale-x 規(guī)格體積（內部數據）
在結構化、螺旋卷式固定床中的Vero細胞分布
在培養(yǎng)的不同階段（2.7×105 cells/cm2和5.3×105 cells/cm2時，圖6），對Vero細胞分布進行了研究。為此，從展開的固定床中提取了9個樣本，并測定細胞密度。
在scale-X hydro生物反應器中，Vero細胞在固定床中軸向和徑向均勻分布。研究進行了進一步的計算機流體動力學研究，結果顯示，在結構化固定床中沒有死區(qū)和非均勻性（數據未顯示）。均勻的細胞生長使可用表面積得到充分利用。
圖6. scale-X生物反應器的結構化固定床中的Vero細胞生長分布。
細胞沿徑向（從中心半徑）和軸向（固定床高度）均勻分布。（a.）由Kiesslich et al.（2020）友情提供，（b.）在Univercells實驗室進行。
總結
在這兩種工藝中，貼壁Vero細胞達到了相同的密度。當轉移到更大的固定床scale-X生物反應器時，達到了類似的細胞生長趨勢和最高單位面積細胞密度。最后，對Vero細胞生長分布的研究顯示，固定床內有均勻的細胞貼壁和生長。與微載體工藝相比，固定床的緊湊設計使設備占地面積降低5倍。
總體而言，結果表明，結構化的scale-X固定床生物反應器系統(tǒng)是傳統(tǒng)“規(guī)模擴展”技術的合適替代方案，后者如多層培養(yǎng)皿和滾甁，也包括具有一定技術挑戰(zhàn)性的培養(yǎng)系統(tǒng)，如微載體工藝。
目前的scale- X生物反應器可以轉化至生產規(guī)模（600 m2），并整合到連續(xù)的NevoLine™生產平臺中。NevoLine系統(tǒng)將強化的上游工藝與連續(xù)的下游工藝相結合，以降低資本投入和運營成本，實現低成本、大規(guī)模的生產能力。
參考文獻
Khaled Trabelsi, S. R. (2004). Comparison ofvarious culture modes for the production of rabies virus by Vero cells grown onmicrocarriers in a 2-l bioreactor. Enzyme and Microbial Technology.
Kiesslich, S.V.-C.-F. (2020). Serum-free production of rVSV-ZEBOV in Vero cells:Microcarrier bioreactor versus scale-X™ hydro fixed-bed. Journal of Biotechnology.
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