​使用懸浮或貼壁細(xì)胞系進(jìn)行基因治療的商業(yè)化生產(chǎn)

Alex Chatel 和 Jean-Christophe Drugmand

本文將探討從實(shí)驗(yàn)室到臨床的傳統(tǒng)路徑，以及scale-X 固定床技術(shù)如何提供一種替代解決方案，以滿足商業(yè)化需求。

有報(bào)告依此預(yù)計(jì)，到2023年，基因治療市場(chǎng)將達(dá)到30億美元，復(fù)合年增長(zhǎng)率 (CAGR) 達(dá)34%，這使其成為生物制藥市場(chǎng)增長(zhǎng)最快的領(lǐng)域之一。最初，基因治療的普及是因?yàn)樗�能夠治療以前無(wú)法治愈的罕見疾��；然而，這些產(chǎn)品在治療癌癥等更常見的疾病方面正獲得越來越多的關(guān)注。基因治療中最常用的病毒載體是腺相關(guān)病毒 (AAV) 和慢病毒 (LV)，但是，腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒在這個(gè)領(lǐng)域也很受關(guān)注 (后者主要用于嵌合抗原受體T (CAR-T) 細(xì)胞治療)，而此類病毒載體必須在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生。盡管也有報(bào)導(dǎo)開發(fā)穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞系，但行業(yè)一般選擇使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（transient transfection）作為將病毒基因組整合到細(xì)胞中的手段。人胚腎293是最常見的宿主細(xì)胞；此外，昆蟲細(xì)胞也較常使用。此類細(xì)胞源于組織，因此傾向于貼壁生長(zhǎng)，但也可經(jīng)馴化后在懸浮培養(yǎng)中生長(zhǎng)。

基因治療開發(fā)商在早期階段的主要驅(qū)動(dòng)力是快速進(jìn)入臨床，以證明產(chǎn)品的有效性，從而為工業(yè)化籌集更多的資金。與此同時(shí)，選擇用于臨床物料生產(chǎn)的平臺(tái)必須是可放大的，以達(dá)到目標(biāo)產(chǎn)能并優(yōu)化成本效益。在開發(fā)的早期階段，貼壁細(xì)胞系是最常見的選擇，因其容易獲得，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模條件下易于培養(yǎng)，且對(duì)生物工程專業(yè)知識(shí)的要求較低。

隨著基因治療產(chǎn)品進(jìn)入臨床以及生產(chǎn)規(guī)模的提高，開發(fā)商可能會(huì)考慮切換到懸浮細(xì)胞系，因?yàn)檫@種方式被認(rèn)為具有可規(guī)模放大的優(yōu)勢(shì)，可以使用眾所周知的攪拌罐生物反應(yīng)器 (STR) 更為簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，而不是使用多層平面培養(yǎng)系統(tǒng)。為了減少前期支出并克服缺少生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)所帶來的挑戰(zhàn)，開發(fā)商通常會(huì)選擇與CDMO企業(yè)合作，后者可能會(huì)幫助選擇細(xì)胞系，因?yàn)橛行〤DMO可提供專利系統(tǒng)。促使開發(fā)商考慮懸浮細(xì)胞系的另一個(gè)驅(qū)動(dòng)因素是，出于生物安全、成本、供應(yīng)和工藝需求等方面的考慮，希望避免使用血清。然而，在工業(yè)生產(chǎn)中使用懸浮馴化的細(xì)胞也存在一些缺點(diǎn)，這將在后文進(jìn)行討論。最近的技術(shù)發(fā)展已經(jīng)幫助開發(fā)了更為先進(jìn)的固定床生物反應(yīng)器 (FBR)，能夠使用貼壁細(xì)胞系成功且經(jīng)濟(jì)高效地用于基因治療產(chǎn)品的開發(fā)和商業(yè)化，相比基于懸浮培養(yǎng)的系統(tǒng)，其具有多方面的優(yōu)勢(shì)。

Scale-X生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)

從歷史上看，攪拌罐生物反應(yīng)器是從化工行業(yè)演變而來的，其開始是為了滿足釀造業(yè)的需要，然后是生物制藥行業(yè)，以獲得可負(fù)擔(dān)得起的生物藥產(chǎn)品。攪拌罐生物反應(yīng)器有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：可規(guī)模放大，實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的原理已眾所周知；攪拌罐生物反應(yīng)器可實(shí)現(xiàn)對(duì)培養(yǎng)條件精確、可重復(fù)的控制；且攪拌罐生物反應(yīng)器可實(shí)現(xiàn)高度的自動(dòng)化。20世紀(jì)80年代，治療性單克隆抗體(mAb) 的興起，推動(dòng)了人們對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO )細(xì)胞進(jìn)行懸浮馴化、以便使用攪拌罐生物反應(yīng)器進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的需求。隨后，持續(xù)數(shù)十年的開發(fā)工作進(jìn)一步提高了該細(xì)胞系的穩(wěn)健性，并將產(chǎn)物滴度提高了100倍，從而顯著降低了生產(chǎn)成本。用于基因治療的細(xì)胞還沒有經(jīng)過這個(gè)漫長(zhǎng)的馴化過程，這意味著當(dāng)前用于病毒載體生產(chǎn)的懸浮細(xì)胞系在工業(yè)化生產(chǎn)背景下仍然存在一定的穩(wěn)定性問題，例如，攪拌罐生物反應(yīng)器中存在的剪切力的影響以及對(duì)環(huán)境變化的敏感性(pH、DO、溫度等)，且其需要瞬時(shí)轉(zhuǎn)染步驟來將病毒物料引入細(xì)胞 (雖然存在用于病毒載體的穩(wěn)定生產(chǎn)細(xì)胞，但有多方面的缺陷)。對(duì)于攪拌罐生物反應(yīng)器，已經(jīng)有良好建立的規(guī)模放大策略，且從毫升規(guī)模到6,000升都有一次性使用的選擇。

最近的技術(shù)創(chuàng)新提供了替代性解決方案。突破性的固定床生物反應(yīng)器的發(fā)展為快速開發(fā)和放大作為攪拌罐生物反應(yīng)器替代選擇的貼壁平臺(tái)帶來了新的機(jī)遇。固定床生物反應(yīng)器為細(xì)胞貼壁提供了支持基質(zhì)，同時(shí)可實(shí)現(xiàn)與攪拌罐生物反應(yīng)器相同水平的控制、直接的規(guī)模放大策略以及工業(yè)化生產(chǎn)能力。與攪拌罐生物反應(yīng)器相比，固定床生物反應(yīng)器是 “分離的” 系統(tǒng)，細(xì)胞固定在”床”上，與液體介質(zhì)解耦，這可允許在對(duì)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化的同時(shí)，減少對(duì)細(xì)胞的直接影響、比如剪切力等。盡管是一項(xiàng)相對(duì)較新的技術(shù)，固定床技術(shù)已經(jīng)在基因治療領(lǐng)域獲得了相當(dāng)大的吸引力，因?yàn)樗鼮楣�業(yè)化提供了快速解決方案，降低了工藝開發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)確保穩(wěn)健的規(guī)模放大策略以及使用一次性使用技術(shù)進(jìn)行工業(yè)化批量生產(chǎn)的能力。固定床生物反應(yīng)器將細(xì)胞“捕獲”在一個(gè)固體但可滲透的結(jié)構(gòu)內(nèi)，培養(yǎng)基循環(huán)通過該結(jié)構(gòu)，從而確保足夠的營(yíng)養(yǎng)物和氧氣分布。相比攪拌罐生物反應(yīng)器，固定床的原理可允許細(xì)胞生長(zhǎng)至更高的單位罐體積細(xì)胞密度，從而實(shí)現(xiàn)更緊湊的設(shè)備設(shè)計(jì)以及更低的足跡，同時(shí)獲得與攪拌罐生物反應(yīng)器相當(dāng)?shù)纳�產(chǎn)力。固定床生物反應(yīng)器的罐體積范圍為數(shù)百毫升到約50升，后者產(chǎn)能相當(dāng)于1,000升的攪拌罐生物反應(yīng)器，甚至更高。

生物工藝考量

為了促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，整個(gè)生物反應(yīng)器中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)必須是均勻的。在懸浮培養(yǎng)中,這點(diǎn)通過培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物的供應(yīng)(例批次、補(bǔ)料分批或灌流模式)、小規(guī)模生物反應(yīng)器中頂部氣體循環(huán)或大規(guī)模生物反應(yīng)器中的鼓泡帶入氧氣、以及確保均勻混合的攪拌來實(shí)現(xiàn)，同時(shí)需確保氣體傳質(zhì) (kLa) 充分，且沒有溫度和pH的梯度變化。但如果各個(gè)參數(shù)沒有得到充分的控制，將形成對(duì)細(xì)胞健康有害的環(huán)境。攪拌槳的機(jī)械剪切力以及大量分散的氣泡所引起的氧化應(yīng)激也可能對(duì)細(xì)胞有害。小規(guī)模反應(yīng)器中的混合會(huì)比大規(guī)模反應(yīng)器中的混合效率更高，這意味著在工藝開發(fā)階段，在不妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下，更容易獲得令人滿意的氣體傳質(zhì)。

規(guī)模放大時(shí)，罐總體積( m³) 與可用于熱及氣體傳質(zhì)的面積 (m²) 的比值會(huì)提高，這意味著攪拌和氣體流速必須非線性地增加，以保證足夠的氣體傳質(zhì) (O₂攝入、CO₂脫氣)，并避免非均質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)(營(yíng)養(yǎng)物、pH、氣體)。由于細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中，會(huì)暴露于更高的機(jī)械應(yīng)力以及局部氧化應(yīng)激的風(fēng)險(xiǎn)，可能導(dǎo)致生長(zhǎng)和生產(chǎn)下降。

在固定床生物反應(yīng)器中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體通過固定床結(jié)構(gòu)內(nèi)培養(yǎng)基的循環(huán)或灌流而提供給細(xì)胞，同時(shí)細(xì)胞被固定。細(xì)胞只在接種階段可能與攪拌槳接觸，這意味著它們暴露于高剪切力的幾率有限。但病毒物料會(huì)在罐內(nèi)自由循環(huán)，如果這些物料對(duì)剪切敏感，就需要格外小心。而使用結(jié)構(gòu)化固定床可促進(jìn)均勻的細(xì)胞分布，并可在較低的攪拌速度下進(jìn)行操作，從而降低剪切力暴露。固定床生物反應(yīng)器的罐體積比同等產(chǎn)能的攪拌罐生物反應(yīng)器小得多，因此，進(jìn)行規(guī)模放大或縮小時(shí)，罐體積與用于氣體及熱交換的面積的比值不會(huì)發(fā)生太大變化，更容易保持罐內(nèi)的均勻狀態(tài)。

規(guī)模放大策略

以快速、無(wú)風(fēng)險(xiǎn)且經(jīng)濟(jì)的方式將細(xì)胞培養(yǎng)工藝從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模放大到商業(yè)化規(guī)模是新型基因治療開發(fā)商所面臨的挑戰(zhàn)。理想情況下，在小規(guī)模條件下建立的工藝步驟和條件必須可以線性地轉(zhuǎn)化為大規(guī)模工藝，而不需要在大規(guī)模條件下進(jìn)行再開發(fā)，因該過程將非常昂貴，且會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品上市的延遲。

對(duì)于使用攪拌罐生物反應(yīng)器的懸浮細(xì)胞，種子擴(kuò)增相對(duì)簡(jiǎn)單：在搖瓶中制備接種液，然后逐漸增加體積至生物反應(yīng)器，通常一次增加達(dá)10倍，直到達(dá)到生產(chǎn)規(guī)模罐所需的接種量。在此期間，收獲細(xì)胞，并用作下一個(gè)規(guī)模生物反應(yīng)器的種子。對(duì)于使用固定床生物反應(yīng)器的貼壁細(xì)胞，接種液的準(zhǔn)備包括在培養(yǎng)皿中的初步細(xì)胞生長(zhǎng)，然后是多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶。細(xì)胞酶解脫落，以用于接種固定床生物反應(yīng)器。需小心確保細(xì)胞以單個(gè)單元的形式存在，以促進(jìn)細(xì)胞在整個(gè)固定床內(nèi)的均勻分布，這對(duì)于確保工藝的可預(yù)測(cè)性和可再現(xiàn)性至關(guān)重要。

固定床生物反應(yīng)器的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，由于罐體積較小，在接種時(shí)，細(xì)胞密度高于攪拌罐生物反應(yīng)器，接種所需的細(xì)胞也相對(duì)較少，降低了生成種子的操作負(fù)擔(dān)。在細(xì)胞擴(kuò)增階段，必須確保營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氣體在非限制條件下供應(yīng)，如之前所提到的，在攪拌罐生物反應(yīng)器中，如果不仔細(xì)控制，通常會(huì)產(chǎn)生剪切和氧化應(yīng)激。灌流是維持細(xì)胞培養(yǎng)和達(dá)到高產(chǎn)量的普遍選擇，但需要一定的開發(fā)工作。在攪拌罐生物反應(yīng)器中，必須使用外部細(xì)胞截留裝置，對(duì)此，有一些低剪切的裝置選擇，可將細(xì)胞應(yīng)力最小化。而固定床生物反應(yīng)器在這方面又另具優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榧?xì)胞被固定床”自然”截留，因此無(wú)需復(fù)雜的細(xì)胞截留裝置。這既有利于細(xì)胞(較少暴露于剪切力條件)，也有利于降低工藝的復(fù)雜性和成本。

實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的轉(zhuǎn)染通常是在理想的條件下進(jìn)行的，此時(shí)，可選擇性地進(jìn)行漂洗步驟，以將培養(yǎng)基去除并置換為轉(zhuǎn)染混合液。這通常不容易在攪拌罐生物反應(yīng)器中大規(guī)模地進(jìn)行，因?yàn)檫@將需要處理數(shù)百到數(shù)千升的液體。相反，要么通過過濾將細(xì)胞進(jìn)行濃縮，要么將混合液直接添加到細(xì)胞培養(yǎng)中。兩種方法都有缺點(diǎn)：濃縮是一個(gè)額外的操作步驟，需要時(shí)間和工藝開發(fā)，而在不進(jìn)行預(yù)漂洗步驟的條件下，以與工藝開發(fā)時(shí)不同的最終濃度加入轉(zhuǎn)染混合液，必須進(jìn)行工藝的重新開發(fā)，以確保轉(zhuǎn)染效率。此外，轉(zhuǎn)染混合液對(duì)pH值的變化敏感，因此，大規(guī)模反應(yīng)罐中的不均勻性也是問題的來源。而在固定床生物反應(yīng)器中，這又是另一個(gè)故事：只要罐體積和可用于生長(zhǎng)的表面積之比保持相同，在小規(guī)模條件下開發(fā)的轉(zhuǎn)染工藝就可直接且線性地轉(zhuǎn)移到大規(guī)模培養(yǎng)中，而不需要濃縮、稀釋或者重新開發(fā)轉(zhuǎn)染混合液。

總結(jié)

雖然基于懸浮的細(xì)胞培養(yǎng)工藝已經(jīng)被成功地用于生物藥的放大生產(chǎn)，并獲得了相當(dāng)高的產(chǎn)物滴度以及相對(duì)較低的產(chǎn)品成本，但其在基因治療產(chǎn)品生產(chǎn)中的應(yīng)用受到攪拌罐生物反應(yīng)器在基本機(jī)制和操作局限性等方面固有缺陷的妨礙，這會(huì)影響產(chǎn)量，并導(dǎo)致工藝復(fù)雜化。新興的固定床生物反應(yīng)器技術(shù)可實(shí)現(xiàn)貼壁細(xì)胞系經(jīng)濟(jì)高效的工業(yè)規(guī)模應(yīng)用，其獲得的可放大、可再現(xiàn)、且更為簡(jiǎn)化的工藝(例如縮短種子擴(kuò)增鏈、有效的轉(zhuǎn)染以及更低的工藝體積)將扮演越來越重要的角色，確�；�因治療產(chǎn)品生產(chǎn)能達(dá)到市場(chǎng)所需的足夠的產(chǎn)量，并將其成本降低至可負(fù)擔(dān)的水平。

歡迎在線免費(fèi)觀看 BELSACT 會(huì)議講座，注冊(cè)詳情http://belsact.com/belsact-event

參考文獻(xiàn)

1. Grand View Research, "Gene Therapy MarketSize, Share & Trends Analysis," 2019.
2. Markets and Markets, "Gene Therapy Market byVectors," 2019.
3. F. Masri, E. Cheeseman, and S. Ansorge, Cell & Gene Therapy Insights, 5 (S5) 949-970 (2019).
4. O.-W. Merten, M. Schweizer, A. Kamen, and P.Chahal, Pharmaceutical Bioprocessing, (2014).
5. R. Kunert and D. Reinhart , Appl MicrobiolBiotechnol, 100 3451–3461 (2016).
6. R. Gilbert, Cell & gene therapy insights, 6 (1)143-148 (2020).
7. V. Barba, "ABEC launches 6,000 L single-usebioreactor to answer scalability needs," BioPharma-Reporter.com, Sept.12,2019.

關(guān)于作者

Jean-Christophe Drugmand是Univercells Technologies的高級(jí)生物工藝設(shè)計(jì)師，專注于創(chuàng)新和概念設(shè)計(jì)，Alex Chatel是Univercells Technologies scale-X生物反應(yīng)器產(chǎn)品經(jīng)理。

Univercells S.A.
Headquarters & Bioprocess Design Center: 
Rue Auguste Piccard 48, 6041 Gosselies, Belgium

Administration & Business Office: 
Avenue de Tervueren 270, 1150 Woluwe-Saint-Pierre, Belgium
Contact: （+32）2 318 83 48
info@univercells.com
www.univercells.com

中國(guó)地區(qū)聯(lián)系人：
葉愛珊
a.yip@univercellstech.com
 

© Univercells S.A.
Univercells and Univercellstech logos are trademarks of Univercells S.A