HAT培養(yǎng)基在雜交瘤細(xì)胞篩選的應(yīng)用

1964年Littlefield首先發(fā)明了HAT(H-Hypoxanthine次黃嘌呤，A-Aminopterin氨基蝶呤，T--Thymidine 胸腺嘧啶核苷)培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)。

 

HAT培養(yǎng)基是指含有次黃嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidin）三種物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基，說(shuō)起HAT培養(yǎng)基，我們可能會(huì)想到這是用于雜交瘤細(xì)胞篩選的常用培養(yǎng)基。是的，首先給大家介紹一下細(xì)胞內(nèi)DNA原料核苷酸的兩種主要合成途徑：

 

（1）主要合成途徑：生物體內(nèi)嘌呤核苷酸合成，首先由5-磷酸核糖焦磷酸合成次黃嘌呤核苷酸，次黃嘌呤核苷酸合成后，經(jīng)氨基化即可形成腺嘌呤核苷酸；經(jīng)氧化和氨基化即可形成鳥(niǎo)嘌呤核苷酸。再來(lái)看嘧啶核苷酸的合成，生物體內(nèi)先先由氨甲酰磷酸和天冬氨酸合成尿嘧啶核苷酸，然后尿嘧啶核苷酸經(jīng)磷酸化、氨基化就可形成胞嘧啶核苷三磷酸；在核糖核酸還原酶的還原作用下可形成尿嘧啶脫氧核糖核苷酸，再經(jīng)過(guò)甲基化后可形成胸腺嘧啶核苷酸。

 

（2）旁路合成途徑：利用次黃嘌呤—鳥(niǎo)嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應(yīng)的核苷酸。

 

 

既然體內(nèi)有兩條核酸合成途徑，那么我們是否可以抑制其中一條途徑然后利用另一條來(lái)進(jìn)行篩選呢？科學(xué)先驅(qū)們想出了如下方法利用核酸的合成途徑來(lái)制備雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體：

 

將B細(xì)胞于腫瘤細(xì)胞進(jìn)行融合培養(yǎng)后，在一款選擇培養(yǎng)基中添加某些物質(zhì)來(lái)阻斷核酸的主要合成途徑，那么未融合的瘤細(xì)胞和自身融合的瘤細(xì)胞在篩選過(guò)程中就會(huì)死去，能存活下來(lái)的就只有能進(jìn)行旁路途徑合成核酸的B細(xì)胞和瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞了

 

 

根據(jù)這一設(shè)想，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)了HAT選擇性培養(yǎng)基，其中H代表次黃嘌呤，A代表氨基蝶呤，T代表胸腺嘧啶核苷酸。

 

 

A—氨基蝶呤為葉酸的結(jié)構(gòu)類似物，正是它阻斷了核酸合成的主要途徑，阻礙了次黃嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸的合成。H—次黃嘌呤，可經(jīng)核酸合成旁路途徑合成次黃嘌呤核苷酸，從而完成嘌呤核苷酸的補(bǔ)救合成。T—胸腺嘧啶核苷酸，直接添加到培養(yǎng)基中來(lái)補(bǔ)足被阻斷的嘧啶核苷酸的合成。

 

HAT選擇培養(yǎng)基篩選原理

 

HAT培養(yǎng)基是指將上述三種物質(zhì)按照一定的配比合成的細(xì)胞培養(yǎng)基。再細(xì)胞合成DNA原理——各類核苷酸的時(shí)候，氨基蝶呤可阻礙主要合成途徑，所以培養(yǎng)基中含有它時(shí)，細(xì)胞便只能通過(guò)旁路合成途徑合成核苷酸或者額外供給核苷酸。至于缺失中間合成途徑的細(xì)胞，由于失去增殖能力逐漸死亡。根據(jù)這一點(diǎn)，不僅把混存于細(xì)胞群中的正常細(xì)胞，通過(guò)試管內(nèi)培養(yǎng)進(jìn)行選擇，例如嘌呤的中間合成途徑缺失株和嘧啶的中間合成途徑缺失株，由于可以互補(bǔ)，所以兩者的融合細(xì)胞，即使在氨基蝶呤的存在條件下也可以增殖。在這種情況下，利用HAT培養(yǎng)基可對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行篩選，次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷可作為中間合成途徑的原料添加到培養(yǎng)基中。

 

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