Echo Revolve正倒置一體熒光顯微鏡在骨骼肌挫傷修復(fù)研究中的應(yīng)用

近日在《Stem Cells and Development》期刊雜志上發(fā)表題為《Bone Marrow Stromal Cell-Derived Exosomes promote muscle healing following contusion through macrophage polarization》的文章。在這項(xiàng)研究中，使用梯度離心從BMSC的上清液中分離和純化外泌體。納米粒子跟蹤分析，透射電子顯微鏡和蛋白質(zhì)印跡被用來(lái)鑒定外泌體。使用ECHO正倒置一體熒光顯微鏡對(duì)HE染色，Masson染色和免疫熒光的肌肉樣本進(jìn)行成像。最后得到的結(jié)論：BMSC-Exos通過(guò)改變巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)抑制炎癥反應(yīng)，減輕了小鼠的肌肉挫傷損傷并促進(jìn)了肌肉的愈合。

 

背景介紹：

骨骼肌挫傷是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和臨床最常見(jiàn)的損傷之一。由于挫傷后局部纖維化形成，受傷的肌肉很容易再次受傷，骨骼肌纖維化被證明與損傷初期的過(guò)度炎癥反應(yīng)有關(guān)，而與炎癥浸潤(rùn)密切相關(guān)的巨噬細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)在骨骼肌的愈合過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。如何調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化仍然是肌肉愈合的重要問(wèn)題。

最近的研究表明，骨髓基質(zhì)細(xì)胞源性外泌體（BMSC-Exos）可以影響炎癥和組織恢復(fù)。因此，作者假設(shè)BMSC-Exos可以通過(guò)影響巨噬細(xì)胞極化來(lái)下調(diào)炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)挫傷后骨骼肌的愈合。在這項(xiàng)研究中，作者從BMSC中分離了BMSC-Exos，在體內(nèi)和體外測(cè)試了它們的功能，并研究了BMSC-Exos對(duì)巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)和肌肉愈合影響的潛在機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)方法：

通過(guò)粒度分析、透射電鏡和Western Blot方法鑒定外泌體，為了檢查靶蛋白的表達(dá)和位置，在TA（脛前�。┣衅�上進(jìn)行了免疫熒光染色。使用的一抗是抗CD206，抗α-SMA，抗MyoD和抗Pax7，DAPI用于定位細(xì)胞核，通過(guò)熒光顯微鏡（ECHO Revolve，美國(guó)）觀察圖像。

結(jié)果：

總體外觀，相對(duì)重量，形態(tài)特征：挫傷損傷后3d，挫傷組的TA肌肉比BMSC-Exos組的肌肉血腫更大（圖3A）。兩組之間在第三天，TA肌肉的相對(duì)肌肉重量也顯著不同，挫傷組的TA肌肉較重（圖3B）。

對(duì)于HE染色，在陰性對(duì)照組中，肌肉纖維規(guī)則且密集地排列。但是，在挫傷組中，隨著時(shí)間的流逝，肌肉纖維變得越來(lái)越分散，許多增殖的膠原纖維占據(jù)了肌肉纖維的空間，這些現(xiàn)象在BMSC-Exos組中得到了改善。Masson染色中，在挫傷組中觀察到大量膠原纖維，而B(niǎo)MSC-Exos治療在所有時(shí)間點(diǎn)均顯著減少了纖維化區(qū)域（圖3C-D）。

 

▲ 圖3     

此外，為了進(jìn)一步檢查纖維化狀況，作者對(duì)平滑肌肌動(dòng)蛋白α（α-SMA）進(jìn)行了免疫熒光染色。形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，BMSC-Exos治療顯著降低了挫傷在不同時(shí)間點(diǎn)引起的高蛋白表達(dá)和α-SMA的廣泛分布（圖4）。巨噬細(xì)胞耗竭后，BMSC-Exos的抗纖維化作用受到抑制，挫傷和BMSC-Exos治療組在第14天均觀察到大的纖維化區(qū)域和廣泛分布的α-SMA蛋白。

 

▲圖4：免疫熒光法檢測(cè)7d，14d和28d三組在平滑肌肌動(dòng)蛋白α（α-SMA）的相對(duì)表達(dá)和分布，包括標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組，挫傷組和BMSC-Exos組（挫傷+ BMSC-Exos注射）。綠色信號(hào)表示α-SMA，藍(lán)色信號(hào)表示核。放大100倍。

為了確定衛(wèi)星細(xì)胞的不同成肌狀態(tài)，進(jìn)行了Pax7和MyoD的共定位。形態(tài)上，從受傷后3天開(kāi)始，總的Pax7 + / MyoD +衛(wèi)星細(xì)胞顯著增加。顯然，BMSC-Exos治療組的數(shù)量多于挫傷組和陰性對(duì)照組。在三個(gè)不同的組中，相對(duì)的Myod蛋白表達(dá)也呈現(xiàn)出類似的趨勢(shì)（圖5D）。綜上所述，BMSC-Exos注射液可在早期促進(jìn)肌肉再生。

 

▲圖5：第3天采用免疫熒光法檢測(cè)Pax7和Myod1的相對(duì)表達(dá)和分布。綠色、紅色和藍(lán)色信號(hào)分別代表Myod1、Pax7和細(xì)胞核。200×放大。箭頭指向Pax7和Myod1陽(yáng)性細(xì)胞。

結(jié)論：

研究表明局部使用BMSC-Exos可以減少挫傷后的纖維化組織，增強(qiáng)肌肉再生并改善骨骼肌的生物力學(xué)特性。BMSC-Exos通過(guò)促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化，抑制了受傷肌肉的炎性微環(huán)境。作者的研究為BMSC-Exos在臨床實(shí)踐中可用于肌肉愈合提供了有力的支持。

 

Revolve正倒置一體顯微鏡 

Revolve展現(xiàn)了其非凡的靈活性，可以輕松地實(shí)現(xiàn)正置和倒置顯微鏡轉(zhuǎn)換，創(chuàng)新性地把正倒置顯微鏡合二為一，開(kāi)啟了顯微鏡Hybrid時(shí)代。

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多達(dá)4個(gè)EPI熒光通道，無(wú)須暗室，就可以輕松快速地完成多色熒光顯微分析。

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通過(guò)iPad Pro點(diǎn)觸操控相機(jī)及熒光通道之間的切換，實(shí)現(xiàn)了完全自動(dòng)化操作。

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基于IOS的Echo App是與Apple團(tuán)隊(duì)合作研發(fā)的專業(yè)顯微鏡軟件。

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參考文獻(xiàn)：

Zhiwen Luo1*, Jinrong Lin1*, Yaying Sun1*, Chenghui Wang1, and Jiwu Chen1#：

Bone Marrow Stromal Cell-Derived Exosomes promote muscle healing following contusion through macrophage polarization.Stem Cells and Development DOI: 10.1089/scd.2020.0167