His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒操作步驟（以大腸桿菌為例）

使用說明：
對于用鎳柱純化大腸桿菌中His標(biāo)簽蛋白比較熟悉的使用者可以直接參考“4. 簡化的操作流程”。否則請參考如下詳細(xì)內(nèi)容：
如下以最常見的大腸桿菌中表達(dá)純化His標(biāo)簽重組蛋白為例，說明本產(chǎn)品的使用方法。在其它體系中表達(dá)時，請參考該表達(dá)體系的相關(guān)使用說明，并借鑒大腸桿菌中純化His標(biāo)簽重組蛋白的使用說明。

1.大腸桿菌中可溶性His標(biāo)簽重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
如下以最常用的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)給予說明，誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化請參照所使用的誘導(dǎo)表達(dá)體系的詳細(xì)說明。其它誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)請參考適當(dāng)?shù)氖褂谜f明進(jìn)行。
a.挑取表達(dá)His標(biāo)簽重組蛋白的單克隆，接種到3ml或10-20ml含適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)過夜。
b.按照1:20的比例取培養(yǎng)過夜的菌液，接種到預(yù)熱至37℃并含適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)液中。例如取5ml培養(yǎng)過夜的菌液接種到100ml預(yù)熱至37℃并含適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)液中。具體的培養(yǎng)體積視需要純化的蛋白量而定，初步的鑒定培養(yǎng)3-10ml即可；常規(guī)的表達(dá)純化，通常可考慮培養(yǎng)100-200ml；制備型的純化，培養(yǎng)體積可以達(dá)到1L或更大。如果希望取得更好的表達(dá)效果，建議按照1:100的比例接種過夜培養(yǎng)的菌液，但后續(xù)培養(yǎng)至相應(yīng)的OD值需要更長的時間。
c.37℃常規(guī)培養(yǎng)約30-60min或更長時間，至菌液的OD600達(dá)到0.5-0.7，并且OD600最好接近0.6。
d.加入IPTG至終濃度為1mM，繼續(xù)培養(yǎng)4-5小時。
注：可以在加入IPTG前取出少量菌液同樣培養(yǎng)4-5小時后作為未誘導(dǎo)的對照，也可以在加入IPTG前直接取出少量菌液作為未誘導(dǎo)的對照。對于特定蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，最佳的IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、和誘導(dǎo)時間需要通過實(shí)驗(yàn)確定。
e.收集菌液至離心管中，4℃ 4,000g離心20min或4℃ 15,000g離心1min，棄上清，收集沉淀。隨后即可進(jìn)入細(xì)菌裂解步驟，也可以在-20℃或-80℃凍存?zhèn)溆�。冷凍保存的菌體使用前需置于冰上解凍15min。

2.非變性條件下His標(biāo)簽蛋白的小量純化：
本方法常用于小量樣品的快速分析和鑒定，為后續(xù)大量制備打下基礎(chǔ)。
a.接步驟1(e)，離心收集1ml菌液的細(xì)菌沉淀并棄上清，加入100μl非變性裂解液，將細(xì)菌沉淀充分重懸于裂解液中，可進(jìn)行輕微的vortex(盡量避免產(chǎn)生氣泡)。
注：根據(jù)His標(biāo)簽重組蛋白表達(dá)的豐度，菌液和裂解液的體積比可以在25:1-5:1范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整。表達(dá)豐度非常高時，每毫升菌液沉淀可以加入200μl裂解液；表達(dá)豐度非常低時，每毫升菌液沉淀可以加入40μl裂解液。相關(guān)溶液的配制方法附后。本非變性裂解液可以確保裂解絕大多數(shù)可溶性蛋白和包涵體蛋白，裂解后可以直接用于SDS-PAGE。如有必要，可以在裂解細(xì)菌之前，在裂解液中添加適量的蛋白酶抑制劑混合物。
b.加入溶菌酶至1mg/ml并輕輕混勻，盡量避免產(chǎn)生氣泡，冰水浴或冰上放置30min。
注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，臨使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以適當(dāng)分裝后-20℃保存。
c.輕輕vortex數(shù)下，以充分裂解細(xì)菌，盡量避免產(chǎn)生氣泡。
d.4℃離心(15000g×10min)，取10μl上清留樣作后續(xù)檢測用，收集余下上清至一新的潔凈離心管中。
e.加入20μl混合均勻的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin，4℃在搖床上緩慢搖動30min，以充分結(jié)合帶His標(biāo)簽的目的蛋白。
注：緩慢搖動30min已經(jīng)可以確保蛋白充分結(jié)合，但可以根據(jù)時間安排的需要緩慢搖動更長時間甚至緩慢搖動過夜。經(jīng)測試，直接使用50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin也能獲得良好的純化效果。但如果希望獲得更高的標(biāo)簽蛋白得率，可以參考步驟3f，用一個柱體積的非變性裂解液平衡BeyoGold™ His-tag Purification Resin 2-3次。平衡后，視不同的待純化蛋白而定，待純化蛋白的得率有可能會提高約5-20%左右。
f.4℃離心(1000g×10s)沉淀凝膠，取20μl上清留樣作后續(xù)檢測用，其余上清棄去。
g.加入40μl非變性洗滌液重懸凝膠，4℃離心(1000g×10s)，取20μl上清留樣作后續(xù)檢測用，其余上清棄去。
h.重復(fù)步驟g，再進(jìn)行一次洗滌。
i.加入20μl非變性洗脫液，輕輕重懸凝膠。4℃離心(1000g×10s)，收集上清及凝膠。上清即為純化獲得的帶有His標(biāo)簽的目的蛋白。
j.重復(fù)步驟i兩次。共洗脫收集約60μl純化的蛋白樣品。

3.非變性條件下His標(biāo)簽蛋白的大量純化：
a.接步驟1(e)，對于新鮮的或解凍的細(xì)菌沉淀，按照每克細(xì)菌沉淀濕重加入4ml(2-5ml均可)非變性裂解液的比例加入裂解液，充分重懸菌體。如有必要，可以在裂解細(xì)菌之前，在裂解液中添加適量的蛋白酶抑制劑混合物。
b.加入溶菌酶至終濃度為1mg/ml并混勻，冰水浴或冰上放置30min。
注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，臨使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以適當(dāng)分裝后-20℃保存。
c.冰上超聲裂解細(xì)菌。超聲功率200-300W，每次超聲處理10s，每次間隔10s，共超聲處理6次。
注：具體超聲處理的方式須根據(jù)特定型號的超聲儀器自行摸索和優(yōu)化。
d.(可選做)如果超聲處理后裂解液非常粘稠，可以加入RNase A至10μg/ml及DNase I至5μg/ml，冰上放置10-15min�；蛘咭部梢允褂眠m當(dāng)?shù)难b好了較細(xì)針頭的注射器，反復(fù)抽吸數(shù)次，以剪切粘稠的基因組DNA等。
e.4℃ 10,000g離心20-30min，收集細(xì)菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上�？梢匀�20μl上清留作后續(xù)檢測用。
注：上清必須保持澄清，即不含任何不溶物，才能進(jìn)行下一步的純化。上清中如果混有不溶性雜質(zhì)會嚴(yán)重影響后續(xù)純化獲得蛋白的純度。
f.取1ml混合均勻的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin，4℃離心(1000g×10s)棄去儲存液，向凝膠中加入0.5ml非變性裂解液混勻以平衡凝膠，4℃離心(1000g×10s)棄去液體，再重復(fù)重復(fù)平衡1-2次，棄去液體。將約4ml細(xì)菌裂解液上清加入其中，4℃在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動60min。
注：BeyoGold™ His-tag Purification Resin也可以不平衡直接使用，但蛋白的得率有可能會有5-20%的下降。
g.將裂解液和BeyoGold™ His-tag Purification Resin的混合物裝入試劑盒提供的親和層析柱空柱管中。
注：也可先取1ml混合均勻的50% BeyoGold™ His-tag Purification Resin裝柱，然后用0.5ml非變性裂解液平衡2-3次后加入約4ml細(xì)菌裂解液上清，后續(xù)可以把穿流液收集后重復(fù)上柱3-5次以充分結(jié)合目的蛋白。先混合后裝柱的方式操作起來相對麻煩一些，但更有利于帶有His標(biāo)簽重組蛋白與鎳柱的充分結(jié)合，特別是當(dāng)His標(biāo)簽被蛋白本身部分遮擋或His標(biāo)簽重組蛋白濃度很低時與鎳柱的結(jié)合效率會高一些。
h.將純化柱底部的蓋子打開，在重力作用下使柱內(nèi)液體流出，收集約20微升穿流液作后續(xù)分析用。
i.洗柱5次，每次加入0.5-1ml非變性洗滌液，每次均收集約20微升穿柱的洗滌液用于后續(xù)的分析檢測用。洗柱及下一步洗脫過程中可以用Bradford法簡單快速地檢測每次洗滌液和洗脫液中的蛋白含量，從而考慮增加或減少洗滌和洗脫的次數(shù)。
注：如果出現(xiàn)后續(xù)獲得蛋白純度不夠高的情況，可以再增加洗柱次數(shù)2-3次。
j.洗脫目的蛋白6-10次，每次用0.5ml非變性洗脫液洗脫。將每次的洗脫液分別收集到不同的離心管中。收集獲得的洗脫液即為純化的His標(biāo)簽蛋白樣品。蛋白純化效果可以參考圖1。

圖1. His標(biāo)簽重組蛋白純化效果圖。M: marker; CL：細(xì)菌裂解液(cell lysate)；FT：上樣穿流液(flow through)；W1-W3：洗滌液1-3 (wash 1-3)；E1-E4：洗脫液1-4 (elution 1-4)。注：實(shí)際的電泳結(jié)果會因樣品、上樣量等的不同而有所不同。

4.簡化的操作流程：
a.細(xì)菌中的目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后，離心沉淀細(xì)菌。
b.每克細(xì)菌沉淀濕重加入4ml非變性裂解液，可添加適量蛋白酶抑制劑，充分重懸細(xì)菌。
c.加入溶菌酶至終濃度為1mg/ml并混勻，冰水浴或冰上放置30min。
注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，臨使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以適當(dāng)分裝后-20℃保存。
d.冰上超聲裂解細(xì)菌，離心取上清。
e.BeyoGold™ His-tag Purification Resin裝柱，1ml非變性裂解液平衡純化柱2次。
f.步驟4d中的上清上柱。
注：上清上柱是可以收集穿流液并重復(fù)上柱3-5次，以充分結(jié)合His標(biāo)簽蛋白。
g.用0.5ml非變性洗滌液洗柱5次。
注：如果出現(xiàn)咪唑濃度偏低的情況，可以自行添加適量咪唑，如果出現(xiàn)咪唑濃度偏高的情況，可以使用試劑盒提供的非變性裂解液作為洗滌液使用。
h.用0.5ml非變性洗脫液洗脫6-10次。
注：通常該洗脫條件會比較理想。如果出現(xiàn)洗脫效果欠佳的情況，可以自行提高咪唑濃度至100-250mM。

常見問題：
如果純化不成功，可以對純化過程中收集的每個組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，分析其原因。
蛋白無法與BeyoGold™ His-tag Purification Resin結(jié)合
1.測序檢查基因序列的讀碼框是否正確。
2.嘗試將標(biāo)簽加在蛋白的另一端。
3.增加BeyoGold™ His-tag Purification Resin與蛋白結(jié)合時間(如4℃過夜)。
4.如果使用預(yù)裝柱，可收集裂解液上柱后的穿流液并多次重復(fù)上柱。
5.檢查所有緩沖液和溶液的pH值是否正確。
6.確認(rèn)體系中所用各種試劑的濃度在鎳柱的耐受范圍以內(nèi)。
7.降低結(jié)合緩沖液中的咪唑濃度。
目的蛋白被洗滌液洗脫
1.降低洗滌液中的咪唑濃度或者稍微提高其pH值。
2.檢查洗滌液的pH和成分。
3.確認(rèn)洗滌液中各種試劑的濃度在耐受范圍內(nèi)。
蛋白在純化過程中形成沉淀
1.將純化溫度控制在室溫。
2.加入去垢劑，如0.1% Triton X-100或者Tween-20。
蛋白無法洗脫
1.用梯度pH及咪唑洗脫，確定最優(yōu)洗脫條件。
目的蛋白與其它蛋白共同洗脫
1.提高結(jié)合緩沖液和洗滌液中的咪唑濃度。
2.降低BeyoGold™ His-tag Purification Resin的使用量。
3.加入DTT或β-巰基乙醇打開二硫鍵。
4.增加鹽或者去垢劑濃度，或者向洗滌液中加入乙醇或甘油以降低非特異相互作用。
5.檢查基因內(nèi)部是否含有起始密碼子(C端標(biāo)記蛋白)或者提前終止位點(diǎn)(N端標(biāo)記蛋白)。