膜片鉗顯微鏡照明系統(tǒng)在體外電生理落射熒光成像與光遺傳刺激的應(yīng)用

膜片鉗（Patch-clamp）電生理學(xué)是一種被廣泛運(yùn)用于分析神經(jīng)元內(nèi)在特性及其局部關(guān)聯(lián)的實(shí)驗(yàn)方法。 近年來(lái)，實(shí)驗(yàn)室標(biāo)記整個(gè)大腦神經(jīng)元中特定子集轉(zhuǎn)基因小鼠品系的能力為分析神經(jīng)元回路與研究整個(gè)大腦的神經(jīng)元多樣性提供了新的方案。如今，Alessandro Galloni團(tuán)隊(duì)正在使用可適用于膜片鉗顯微鏡的CoolLED pE-4000照明系統(tǒng)來(lái)將經(jīng)tdTomato標(biāo)記小鼠腦切片中的5層錐體神經(jīng)元可視化，并將它們?cè)O(shè)為細(xì)胞內(nèi)膜片鉗記錄的對(duì)象。

 
在全細(xì)胞膜片鉗記錄中，含5層活錐體神經(jīng)元的腦切片。 膜片鉗電極被附著于一個(gè)處于視場(chǎng)中央經(jīng)tdTomato熒光標(biāo)記神經(jīng)元的體細(xì)胞（soma）。
 
科研人員通常通過(guò)膜片鉗夾神經(jīng)元、以及在電刺激突觸前神經(jīng)元期間測(cè)量其突觸后電位的方式來(lái)研究神經(jīng)元之間的連接。但對(duì)于不同大腦區(qū)域中神經(jīng)元之間的遠(yuǎn)程連接，軸突常在準(zhǔn)備腦切片時(shí)被切斷。在過(guò)去的十年中，隨著光遺傳學(xué)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)了另一種靶向刺激突觸前神經(jīng)元的方法，即在其膜上建立光敏離子通道。從而實(shí)現(xiàn)了即使軸突被切斷，它們的突觸仍能夠用短的光脈沖被直接激活。
 
自光遺傳學(xué)方法被首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，學(xué)界已發(fā)現(xiàn)了更多具有不同動(dòng)力學(xué)、離子滲透性和波長(zhǎng)敏感性的視蛋白。 CoolLED pE-4000提供的大范圍波長(zhǎng)以及在刺激神經(jīng)元時(shí)以毫秒級(jí)精度數(shù)字觸發(fā)它們的能力有效為研究人員在給特定實(shí)驗(yàn)選擇最合適的視蛋白與在其激發(fā)光譜峰值處刺激過(guò)程中提供了更大的靈活性。若兩個(gè)視蛋白具有足夠獨(dú)立的光譜敏感性，例如對(duì)藍(lán)光敏感的Chronos與對(duì)紅光敏感的ChrimsonR，則均能夠在不同的神經(jīng)元群體中表達(dá)并被獨(dú)立控制，從而有助于研究人員評(píng)估每個(gè)視蛋白對(duì)連接現(xiàn)象或單個(gè)突觸后神經(jīng)元活動(dòng)的貢獻(xiàn)。
  
在表達(dá)對(duì)藍(lán)光敏感的視蛋白Chronos與對(duì)紅光敏感的視蛋白ChrimsonR的神經(jīng)元突觸前神經(jīng)末梢的光刺激過(guò)程中，來(lái)自5層錐體神經(jīng)元的電流鉗記錄。
 
帶有CoolLED pE-4000（位于桌面下方）的膜片鉗裝置通過(guò)液體光導(dǎo)被連接于顯微鏡的背面，從而通過(guò)物鏡照亮大腦切片。
 
參考用戶(hù)：弗朗西斯.克里克研究所，Rancz實(shí)驗(yàn)室，倫敦，英國(guó)