體外哺乳類細胞微核試驗原理及注意事項

微核試驗是遺傳毒性研究標準組合試驗之一，在食品，化學品，藥品，農(nóng)藥，飲用水等多類產(chǎn)品的遺傳毒性評價方面得到廣泛應用。與體內(nèi)實驗相比，體外微核試驗更加簡單快速，避免動物個體差異影響，靈敏度高。體外微核試驗主要包括體外哺乳類細胞微核試驗，人外周血淋巴細胞微核試驗，肝原代細胞微核試驗等類別。

體外哺乳類細胞微核試驗是一種用于檢測哺乳類細胞在受試物處理后是否產(chǎn)生微核的遺傳毒性檢測方法。該試驗適用于檢測有絲分裂細胞暴露于受試物期間或之后致染色體斷裂和誘發(fā)非整倍體的能力。如果3h~6h短期處理的試驗結(jié)果為陰性或不確定時，需要進行無代謝活化系統(tǒng)的長期處理試驗，相當于用受試物處理細胞1.5個~2.0個正常細胞周期。
 
參考導則：
GB 15193.28-2020 食品安全國家標準 體外哺乳類細胞微核試驗

一、儀器、試劑

儀器
細胞培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、正置顯微鏡、超凈臺、離心機。

代謝活化系統(tǒng)

1.1 S9輔助因子的配制
1）  鎂鉀溶液
氯化鎂1.9 g和氯化鉀6.15 g加蒸餾水溶解至100 ml。
2）  0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)
磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄，28.4 g/L)440 mL,磷酸二氫鈉(NaH₂PO_4·H2O,27.6 g/L)60 mL，調(diào)pH 至7.4，0.103 MPa 20 min滅菌或濾菌。
3）  輔酶-Ⅱ(氧化型)溶液
無菌條件下稱取輔酶-Ⅱ，用無菌蒸餾水溶解配制成0.025mol/L溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。
4）  葡萄糖-6-磷酸鈉鹽溶液
稱取葡萄糖-6磷酸鈉鹽,用蒸餾水溶解配制成0.05 mol/L 溶液，過濾滅菌�，F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 大鼠肝S9組分的誘導和配制
選健康雄性成年SD或Wistar大鼠，體重150g~200g，約5周齡~6周齡。將多氯-聯(lián)-苯(Aroclor 1254)溶于玉米油中，濃度為200 g/L，按500 mg/kg體重無菌操作一次腹腔注射，5 d后處死動物，處死前禁食12 h。
也可采用苯巴比-妥-鈉和β-萘黃酮聯(lián)合誘導的方法進行制備，經(jīng)口灌胃給予大鼠苯巴比-妥-鈉和β-萘黃酮，劑量均為80 mg/kg體重，連續(xù)3d，禁食16 h后斷頭處死動物。其他操作同多氯聯(lián)苯誘導。
S9組分制成后，經(jīng)無菌檢查，測定蛋白含量(Lowry法)，每毫升蛋白含量不超過40 mg為宜，并經(jīng)間接致突變劑鑒定其生物活性合格后貯存于-80°C低溫或冰凍干燥，保存期不超過1年。

1.3  S9混合液的制備
S9混合液濃度一般為1%~10%，實際使用濃度可由各實驗室決定，但需對其活性進行鑒定，必須能明顯活化陽性對照物，且對細胞無明顯毒性。
一般由S9組分和輔助因子按1:9組成10%的S9混合液，無菌現(xiàn)用現(xiàn)配。10%S9混合液10mL配制方法如下:取上述磷酸鹽緩沖液6.0 mL、鎂鉀溶液0.4 mL、葡萄糖-6-磷酸鈉鹽溶液1.0 mL、輔酶 II溶液1.6 mL、肝S9組分1.0 mL，混勻，置冰浴中待用。

1.4  肌動蛋白聚合抑制劑細胞松弛素B(CytochalasinB，cytoB)溶液
用二甲基亞砜( DMSO)配制適當濃度的儲備液，避光冷藏保存。cytoB的終濃度通常為3μg/ mL ~6μg/mL，實驗室應根據(jù)各種細胞系選擇cytoB的適當終濃度，以達到理想的雙核細胞出現(xiàn)頻率。

1.5  0.075 mol/L氯化鉀溶液
5.59 g氯化鉀加蒸餾水至1000 ml。

1.6  固定液
甲醇:冰醋酸為3:1，臨用前配制。

1.7  姬姆薩(Giemsa)染液
取姬姆薩染料3.8 g ，置乳缽中，加少量甲醇研磨。逐漸加甲醇至375 mL，待完全溶解后，再加 125 mL甘油，放入37° C溫箱中保溫48 h。保溫期間振搖數(shù)次，使充分溶解。取出過濾，2周后使用，作為姬姆薩染液原液。使用時,取1份姬姆薩染液原液，與9份1/15 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)混合,配成其應用液.現(xiàn)配現(xiàn)用。

磷酸鹽緩沖液(1/15 mol/L，pH 6.8)配制方法如下：
1）第一液：取磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄)9.47 g溶于1000 mL去離子水中，配成1/15 mol/L溶液；
2） 第二液：取磷酸二氫鉀(KH₂ PO₄ )9.07 g溶于1 000 mL去離子水中，配成1/15 mol/L溶液；
3） 取第一液50 mL加于第二液50 ml中混勻，即為pH 6.8的1/15 mol/L磷酸鹽緩沖液。

二、 試驗方法

2.1受試物
固體受試物應溶解于適合的溶媒中，并稀釋至適當濃度。液體受試物可直接使用或稀釋至適當濃度使用。受試物應無菌現(xiàn)用現(xiàn)配，否則須確認儲存不影響其穩(wěn)定性。

2.2 細胞
可選用中國倉鼠肺細胞株(V79、CHL)或卵巢細胞株(CHO)、小鼠淋巴瘤細胞株(L5178Y)、人外周血淋巴細胞株(如TK6)和原代培養(yǎng)細胞。推薦使用CHL或L5178Y細胞株。細胞在使用前應進行染色體數(shù)目穩(wěn)定性和有無支原體污染的檢查。匯智泰康體外微核試驗試劑盒推薦使用中國倉鼠肺細胞株（CHL）。

2.3試驗方案選擇
試驗分為使用和不使用cytoB兩種方案。
方案一：在細胞經(jīng)過受試物處理，有絲分裂前使用cytoB，然后觀察分析已完成一次有絲分裂的細胞(雙核細胞)微核率。當選用人類淋巴細胞時,建議采用方案一，因為不同來源的細胞周期不同，而且不是所有的細胞都對植物血球凝集素(PHA)有反應。
方案二：不使用cytoB，細胞經(jīng)過受試物處理后觀察分析細胞微核率。如果有證據(jù)表明受試物干擾cytoB的活性，或cytoB可能影響細胞的生長(如小鼠淋巴瘤細胞株)，建議采用方案二。

2.4 劑量
1） 劑量設置
至少應設置3個檢測劑量。受試物沒有細胞毒性時，從最高劑量往下設至少2個劑量，一般情況下間隔系數(shù)可為2~3；有細胞毒性時，其劑量范圍應涵蓋從55%士5%的細胞毒性到幾乎無細胞毒性。
2） 最高劑量的選擇
決定最高劑量的因素是細胞毒性、受試物的溶解度以及pH、滲透壓。
受試物有細胞毒性時，最高劑量應能引起55%士5%的細胞毒性；如果沒有細胞毒性或沉淀，最高劑量應是5μL/mL、5 mg/ml或10 mmol/L。
對溶解度較低的物質(zhì).當達到最大溶解濃度時仍無毒性，則最高劑量應是在最終培養(yǎng)液中溶解度限值以上的一個濃度。在某些情況下，應使用一個以上可見沉淀的濃度，溶解性可用肉眼鑒別，但沉淀不能影響觀察。
3） 細胞毒性的確定，
在S9存在和不存在兩種條件下依據(jù)細胞完整性和生長情況的指標來確定細胞毒性。
方案一，使用cytoB，細胞毒性的確定可依據(jù)復制指數(shù)(ReplicationIndex,RI)或胞質(zhì)分裂阻斷增殖指數(shù)( Cytokinesis Block Proliferation Index,CBPD)。
 
4） 陽性對照
陽性對照物包括染色體斷裂劑和非整倍體劑。加S9時，斷裂劑可以選用環(huán)磷酰胺和苯并(a)芘；不加S9時，斷裂劑可以選用阿糖胞苷、絲裂霉素C、甲磺酸甲酯和4-硝基喹啉；非整倍體劑只用于不加S9時，可以選用秋水仙素和長春新堿。
如果短期處理試驗方案在S9存在和不存在兩種條件下都選用斷裂劑作為陽性對照，那么長期處理試驗方案應該選用非整倍體劑作為陽性對照。如果選用的細胞本身具有代謝能力，則不需要另外添加S9，陽性對照應該同時使用斷裂劑和非整倍體劑。
5） 陰性對照
溶媒必須是非致突變物，不與受試物發(fā)生化學反應，不影響組胞存活和S9活性。首選溶媒是培養(yǎng)液(不含血清)或水。使用水作為溶媒時其體積不應大于總體積的10%。DMSO也是常用溶媒，但終濃度不應大于1%。
6） 空白對照
如果沒有文獻資料或歷史資料證實所用溶媒無致突變作用時應設空白對照。

2.5試驗步驟
1） 細胞準備
將一定數(shù)量的細胞接種于培養(yǎng)皿(瓶)中，以收獲細胞時，培養(yǎng)皿(瓶)的細胞未長滿為標準，貼壁細胞一般以長到85%左右為佳。
2） 受試物處理

應用方案一，吸去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液洗細胞，加入無血清培養(yǎng)液及一定濃度的受試物(需代謝活化者同時加人S9 mix)，置于培養(yǎng)箱中3h~6h；結(jié)束后吸去含受試物的培養(yǎng)液，用PBS洗細胞，加人含10%血清的新鮮培養(yǎng)液和cytoB，繼續(xù)培養(yǎng)1.5個~2.0個正常細胞周期后收集細胞。
對于淋巴細胞，最有效的方法是在有絲分裂原(如PHA)刺激后44h~48h開始受試物處理，這時細胞開始進入分裂周期。
如果3h~6h短期處理的試驗結(jié)果為陰性或不明確時，需要進行無S9的長期處理試驗，用cytoB和受試物處理細胞1.5個~2.0個正常細胞周期，在處理結(jié)束后收集細胞。
如果已知或懷疑受試物(如核苷類物質(zhì))可能影響細胞周期(特別是P53活性細胞)，則細胞收獲時間應該再延長1.5 個~2.0個正常細胞周期。

應用方案二，與應用方案一處理方法相同，只是不加cytoB。
3） 收獲細胞與制片
每次培養(yǎng)都應單獨收獲細胞和制片，如果細胞混合液的分散度良好則不需要進行低滲處理。
a、消化
貼壁細胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化，待細胞脫落后，加入含10%胎�；蛐∨Ｑ�清的培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的作用，混勻，放人離心管以800r/min~1 000r/min的速度離心5 min，棄去上清液。懸浮細胞不需要消化，直接離心。.
b、低滲
加入0.075 mol/L氯化鉀溶液2 mL，用滴管將細胞輕輕地混勻，放人37°C細胞培養(yǎng)箱中低滲處理 1 min~5 min.
固定
加入2 mL固定液，混勻后固定5 min以上，以800 r/min~1 000 r/min的速度離心5 min，棄去上清液。重復一次，棄去上清液。
c、滴片
加人數(shù)滴新鮮固定液，混勻。用混懸液滴片，自然干燥。
d、染色
推薦用姬姆薩染色(5% ~10%姬姆薩染液，15 min~ 20 min),，也可用DNA特異性熒光染料(如: 吖啶橙或Hoechst  33258)。
如果需要區(qū)分染色體斷裂劑和非整倍體誘變劑，可用熒光原位雜交(FISH)或引物原位標記等方法。
4） 閱片
a、微核的判斷標準：微核一般為圓形或橢圓形，直徑不超過主核的1/3；與主核在一個焦點平面上，與主核的顏色、結(jié)構(gòu)特征及折光性一致；與主核之間沒有核物質(zhì)相連，可以和主核有邊界的重疊，但能看清各自的核膜。
b、應用方案一，每個劑量組至少分析2000個雙核細胞，計算微核細胞率(一個雙核細胞不論含有幾個微核，都只算作一個含微核細胞)。如果單次培養(yǎng)可供計數(shù)的雙核細胞數(shù)少于2000，則應采用多次細胞培養(yǎng)或平行培養(yǎng)。對不規(guī)則的雙核細胞(如兩個核大小相差懸殊)和多于兩個核的細胞不進行分析。
c、應用方案二，每個劑量組至少分析2 000個細胞，計算微核細胞率。如果單次培養(yǎng)可供計數(shù)的細胞數(shù)少于2000，則應采用多次細胞培養(yǎng)或平行培養(yǎng)。

三、數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定 3.1 數(shù)據(jù)處理
數(shù)據(jù)按不同劑量列表，指標包括細胞毒性、觀察細胞數(shù)、含微核細胞數(shù)及微核細胞率。受試物各劑量組與空白對照組、陰性對照組(溶媒對照組)、陽性對照組的微核細胞率用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法(如X²檢驗)進行處理。

3.2結(jié)果判定
下列兩種情況可判定受試物在本試驗系統(tǒng)中為陽性結(jié)果；
a)受試物引起微核細胞率的增加具有統(tǒng)計學意義，并與劑量相關(guān);
b) 受試物在任何一個劑量條件下，引起的微核細胞率增加具有統(tǒng)計學意義，并有可重復性。

四、試驗解釋
陽性結(jié)果表明受試物在該試驗條件下可引起所用哺乳類細胞染色體損傷，微核細胞率增加。陰性結(jié)果表明在該試驗條件下受試物不引起所用哺乳類細胞染色體損傷。評價時應綜合考慮生物學和統(tǒng)計學意義。
 
體外微核試驗試劑盒
北京匯智泰康針對體外哺乳類細胞微核試驗開發(fā)體外微核試驗試劑盒，本試劑盒提供了進行體外哺乳類細胞微核試驗所需的主要試劑和細胞，快速檢測受試物是否有導致染色體斷裂和誘發(fā)非整倍體的情況，從而評價受試物的遺傳毒性，試劑盒的使用可以大大節(jié)約實驗人員的準備時間。

【產(chǎn)品組成】
5mL×32體系/盒。

組分	規(guī)格	數(shù)量	使用說明	保存條件
中國倉鼠肺細胞（CHL）	1 mL	1	貼壁生長	-70℃
S9混合物	1.2mL	1	冰浴融化
S9 PS 反應液	10mL	1	使用前混勻
S9 CS 反應液	0.5mL	1	使用前混勻
環(huán)磷酰胺（CP） （CAS：6055-19-2）	0.2 mL	1	使用前混勻
絲裂霉素C（MMC） （CAS：50-07-7）	0.1mL	1	使用前加入300 μL滅菌蒸餾水混勻
秋水仙素	0.2 mL	1	使用前混勻
細胞松弛素B（cytoB）	540 μL	1	使用前用無菌的1260 μL PBS稀釋，混勻

【產(chǎn)品使用說明】

1、細胞復蘇
收到試劑盒后，請盡快復蘇細胞。
從-70冰箱取出細胞，于37℃水浴融化，離心，棄上清，用含10%牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液（RPMI-10）中重懸細胞后，再次離心；棄上清，用RPMI-10重懸后接種于細胞培養(yǎng)瓶，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后期細胞傳代比例為1:3。

2、細胞準備
將處于對數(shù)生長期，貼壁生長良好的細胞用胰蛋白酶（ Trypsin-EDTA）消化處理制成細胞懸液，5mL/瓶接種于25cm²細胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中加濕培養(yǎng)約24 h-48h。

3、染毒處理
吸去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，加入一定濃度的受試物、S9混合液（不加S9混合液時，需用培養(yǎng)液補足）以及一定量不含血清的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中處理3h。棄去處理液，使用PBS洗滌細胞2~3次，換液后，按1%的比列加入細胞松弛素B（如4.95mL RPMI-10+0.05mL cytoB）。具體試驗方案見下表：

1）10%S9混合液配制
 

10%S9混合液配制（11mL）
S9混合物	1.2mL	現(xiàn)配現(xiàn)用。使用過程中，于冰浴條件下保存。 試驗結(jié)束后，剩余溶液應丟棄，不可重復使用。
S9 PS反應液	0.4mL
S9 CS反應液	補足至10mL

2）推薦染毒培養(yǎng)體系配制方案
 

處理方式	組別	培養(yǎng)液體積（mL）	S9混合液體積（mL）	受試物體積（mL）	溶劑體積（mL）	陽性對照體積（mL）
						CP	MMC	秋水仙素
活化 3h	陽性對照	4.45	0.5	/	/	0.05	/	/
	劑量1	4.45	0.5	0.05	/	/	/	/
	劑量2	4.45	0.5	0.05	/	/	/	/
	劑量3	4.45	0.5	0.05	/	/	/	/
	溶劑對照	4.45	0.5	/	0.05	/	/	/
不活化 3h	陽性對照1	4.95	/	/	/	/	0.05	/
	陽性對照2	4.95	/	/	/	/	/	0.05
	劑量1	4.95	/	0.05	/	/	/	/
	劑量2	4.95	/	0.05	/	/	/	/
	劑量3	4.95	/	0.05	/	/	/	/
	溶劑對照	4.95	/	/	0.05	/	/	/

3）推薦染毒培養(yǎng)體系配制方案
 

處理方式	組別	培養(yǎng)液體積（mL）	CytoB（mL）	受試物體積（mL）	溶劑體積（mL）	陽性對照體積（mL）
						CP	MMC	秋水仙素
不活化 24h	陽性對照	4.90	0.05	/	/	/	0.05	/
	劑量1	4.90	0.05	0.05	/	/	/	/
	劑量2	4.90	0.05	0.05	/	/	/	/
	劑量3	4.90	0.05	0.05	/	/	/	/
	溶劑對照	4.90	0.05	/	0.05	/	/	/

注：24h染毒的陽性底物需將絲裂霉素C稀釋5倍后再使用。由于CytoB使用DMSO溶解的，按照食品標準，陰性對照的有機溶劑含量不得超過1%，若受試物需用有機溶劑溶解，樣品制劑的有機溶劑含量不得超過70%。

4、收獲細胞及制片
用胰蛋白酶溶液消化細胞，加入0.075mol/L氯化鉀溶液進行低滲處理，固定液（甲醇：冰醋酸=3：1，可適當調(diào)整冰醋酸濃度，但不宜過大）進行固定并滴片，用吉姆薩染液染色，中性樹膠封片，并于油鏡下進行閱片，每處理組計數(shù)500個細胞中的增值指數(shù)CBPI和細胞復制指數(shù)RI，計算出細胞毒性；每一劑量組應分析不少于2000個核型相差不大的雙核細胞，計算微核率。

5、數(shù)據(jù)分析計算
6、結(jié)果判定
下列兩種情況可判定受試物在本試驗系統(tǒng)中為陽性結(jié)果：

1. 受試物引起染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)的增加具有統(tǒng)計學意義，并與劑量相關(guān)；
2. 受試物在任何一個劑量條件下，引起的染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)增加具有統(tǒng)計學意義，并有可重復性。

【注意事項】
實驗前請自行準備RPMI 1640培養(yǎng)液、牛血清、細胞培養(yǎng)瓶、0.075mol/L氯化鉀溶液、甲醇、冰醋酸、吉姆薩染液、胰蛋白酶、24孔細胞培養(yǎng)板、滅菌槍頭、無菌移液管、二氧化碳培養(yǎng)箱、振蕩器、15、50mL離心管等，所有耗材需做無菌處理。
 
匯智泰康是一家位于中美兩地的生物醫(yī)藥合同研發(fā)機構(gòu)，整合中美兩地的藥物研發(fā)技術(shù)服務平臺，基于AAALAC、GLP、ISO/IEC 17025實驗室認證，面向全球企業(yè)及研發(fā)機構(gòu)提供分析化學、DMPK、藥理藥效、生物學、以及毒理安全性評價產(chǎn)品與服務。