BLT小課堂丨植物蛋白互作技術(shù)
植物蛋白互作技術(shù)
我們的世界物種多種多樣，而與我們?nèi)祟惿骊P(guān)系最密切的就是植物。隨著時間的推移與科技的進步，人類在逐步揭示自身基因真相的同時，也在不斷探尋植物基因的種種功能。其中，蛋白質(zhì)是植物生命活動的主要承擔者。因此，在植物學相關(guān)研究中，蛋白質(zhì)之間的相互作用是研究的重要基礎(chǔ)和手段。
目前，研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用常用方法主要包括：酵母雙雜交技術(shù) (Yeast Two-hybrid, Y2H)、雙分子熒光互補技術(shù)(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)、免疫共沉淀技術(shù)(Co-Immunoprecipitation, CoIP)及熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)等，以及近幾年來逐步應(yīng)用到的螢火蟲熒光素酶互補技術(shù)(Firefly luciferase complementation
面對眾多的技術(shù)，您是否也苦惱過，到底哪種技術(shù)更加適合我的實驗?zāi)兀恳x擇哪些技術(shù)相互搭配才更加高效呢？面對這一連串的疑問，不要驚慌，今天小編準備了一篇技術(shù)簡報，一起了解一下各類蛋白互作技術(shù)。
酵母雙雜交技術(shù)(Y2H)：
酵母雙雜交技術(shù)是將待研究的兩種蛋白質(zhì)分別克�。ㄈ诤希┑浇湍副磉_質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活域（AD）上，通過2 個結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，從而調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄過程。這兩個結(jié)構(gòu)域分開時仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當被分開的兩者通過適當?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時，才能重新呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）的下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。
優(yōu)點：
① 操作簡單，方便快捷，實驗成本較低；
② 可快速、大量篩選蛋白互作組；
③ 靈敏度高，可檢測存在于微弱或暫時蛋白相互作用。
缺點：
① 自身轉(zhuǎn)錄蛋白往往會造成假陽性的結(jié)果；
② 蛋白過量表達時對酵母產(chǎn)生毒性，使得酵母無法正常生長；
③ 無法檢測細胞核外的蛋白互作。
雙分子熒光互補技術(shù)(BiFC)：
雙分子熒光互補技術(shù)本質(zhì)上是一種蛋白質(zhì)片段互補技術(shù)，是指將熒光蛋白多肽鏈切開并形成不發(fā)熒光的 N-和 C-末端2個多肽片段。當目標蛋白質(zhì)相互作用時，2個片段重新構(gòu)建成完整的具有活性的熒光蛋白分子，即可產(chǎn)生熒光。
優(yōu)點：
① 靈敏度高，直觀可視；
② 可以對在動物、植物和細菌等不同的宿主細胞中蛋白進行定位和互作強度分析；
③ YFP,RFP等熒光標記選擇多樣。
缺點：
① 對溫度條件要求較高，溫度越低，越有利于片段之間的互補；
② 有時2個不發(fā)光的熒光片段會發(fā)生自發(fā)融合的情況，出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。
免疫共沉淀技術(shù)(CoIP)：
借助抗體和抗原之間的專一性，確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性的相互作用。當用預(yù)先固化在argarose beads上的蛋白質(zhì)A的抗體免疫沉淀A蛋白，那么與A蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離，對B蛋白進行檢測，進而證明兩者間的相互作用。
優(yōu)點：
① 常被用于鑒定特定蛋白復(fù)合物中未知的蛋白組分；
② 可分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。
缺點：
① 可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白互作；
② 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用，也可能出現(xiàn)假陽性的結(jié)果；
③ 對抗體選擇和實驗者操作技術(shù)要求較高。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)：
基于兩個熒光基團間能量通過偶極-偶極耦合作用以非輻射方式從供體傳遞給受體的現(xiàn)象,可用于測定分子間的距離。在兩個不同的熒光基團中，如果一個熒光基團（供體 Donor）的發(fā)射光譜與另一個基團（受體 Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當這兩個熒光基團間的距離合適時（一般小于100A），就可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，即以前一種基團的激發(fā)波長激發(fā)時，可觀察到后一個基團發(fā)射的熒光。
優(yōu)點：
① 適用于活細胞和固定細胞的各類分子，
② 靈敏度更高，成像更清晰，最直觀地提供蛋白質(zhì)相互作用的定位和定量信息。
缺點：
① 能量供體與能量受體的光譜、排列方式、量子產(chǎn)率、消光系數(shù)、水溶性、抗干擾能力等方面要求較高。
② 需要更加精密的儀器，技術(shù)難度更高，操作更復(fù)雜。
熒光素酶互補法(LCI)：
最初開發(fā)用于檢測哺乳動物活細胞中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，但后來被用于植物的研究中。借助于煙草的瞬時表達系統(tǒng)，將含有融合蛋白的表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后注射煙草葉片，培養(yǎng)2-3天后，在注射部位均勻涂抹反應(yīng)底物。通過植物活體成像系統(tǒng)和高靈敏度發(fā)光檢測儀檢測生物發(fā)光的強度，從而對蛋白之間的相互作用進行定性和定量分析。此方法已被廣泛應(yīng)用于動植物相關(guān)領(lǐng)域的蛋白質(zhì)互作研究。
原理：將熒光素酶蛋白分為N端和C端2個功能片段, 即NLuc和CLuc。待測的2個目的蛋白分別與NLuc和CLuc融合。當2個目標蛋白相互作用將NLuc和CLuc緊密結(jié)合，恢復(fù)熒光素酶的催化活性，促使熒光素酶底物氧化而發(fā)光。
優(yōu)點：
① 高度定量，允許在幾個數(shù)量級的范圍內(nèi)對發(fā)光信號進行線性測量。
② 與FRET和BiFC相比，此法可對整個組織或細胞群進行采樣，避免了來自單個細胞的偏差。
③ 在黑暗中測量發(fā)光，不受葉綠素和細胞壁產(chǎn)生的自熒光的影響。
④ 可用于在組織水平上研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，該技術(shù)對于研究組織特異性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用非常有用。
⑤ 無需顯微鏡，通過使用植物活體成像系統(tǒng)和板式發(fā)光檢測儀可以在1-2分鐘內(nèi)收集數(shù)據(jù)，進行定性和定量分析，同時檢測大量的蛋白質(zhì)組。
⑥ 需要最少的樣品處理和實驗室培訓，操作簡便，實驗高效。
⑦ LCI作為植物蛋白質(zhì)相互作用研究的簡單工具的可用性將有助于驗證從酵母雙雜交分析中收集的蛋白質(zhì)相互作用組數(shù)據(jù)。
實驗方法：
① 分別將待測蛋白質(zhì)的基因克隆到含有CLuc和NLuc編碼序列的質(zhì)粒中，然后將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。
② 將含有這兩種質(zhì)粒的農(nóng)桿菌細菌浸入本氏煙草中，以便重組DNA可以被傳遞到植物細胞中并穩(wěn)定表達。
③ 收集表達測試蛋白質(zhì)的葉組織，通過植物活體成像系統(tǒng)和高靈敏度發(fā)光檢測儀檢測生物發(fā)光的強度，從而對蛋白之間的相互作用進行定性和定量分析。
圖1 Plantview 100 植物活體成像系統(tǒng)
圖2 Lux-P110 高靈敏度板式發(fā)光檢測儀
技術(shù)總結(jié)
上述5種技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的是Y2H，它可以大規(guī)模篩選相互作用的蛋白對，然而，其檢測有一定的假陽性率和局限性。CoIP則需要特定抗體，受如蛋白質(zhì)提取、結(jié)合和洗滌方案等實驗操作影響較大，使得每個實驗室的結(jié)果往往是不同的。FRET分析技術(shù)都需要精密的顯微鏡和計算，在植物上的應(yīng)用依舊困難重重。與FRET相比，BiFC相對簡單，已用于許多植物蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究，但由于細胞壁、葉綠體和其他細胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的自熒光，F(xiàn)RET和BiFC分析在植物中的應(yīng)用與檢測方法變得十分復(fù)雜。最后，由外部光源激發(fā)熒光引發(fā)的干擾，也使其在植物中的應(yīng)用受限。
因此，采用熒光素酶互補法就具有重要意義。螢火蟲熒光素酶的氨基末端和羧基末端只有在融合到兩個相互作用的蛋白質(zhì)上時才能重建活性熒光素酶，可使用植物活體成像系統(tǒng)來進行觀測。其技術(shù)簡便、可靠、靈敏度高、定量，并已獲得很多文獻的支持，可用于相互作用蛋白的瞬時表達或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達。
