熒光定量Western上樣量疑惑解答與實際操作案例解析

熒光定量Western Blot，絕對不是上樣量越多越好�？煽康腤estern Blot印跡數(shù)據(jù)通過加載適當(dāng)量的樣品才能獲得。加載過多的蛋白會導(dǎo)致信號飽和或用于檢測的熒光基團的自猝滅。

那么，您如何知道要加載多少裂解液呢？首先使用BCA或Bradford等蛋白測定方法測量裂解液樣品的濃度。一旦知道樣品的濃度，便可以確保每種樣品的加載量相同。

于此同時，您仍然需要一種方法來校準凝膠加載量和轉(zhuǎn)印效率的問題。蛋白印跡定量的最佳方法和新共識是將蛋白進行歸一化。許多期刊都接受了總蛋白質(zhì)歸一化（TPN），有些期刊（例如《JBC》）甚至要求作者在Western印跡的定量數(shù)據(jù)時使用TPN或使用驗證過的看家蛋白進行歸一化。

在下面的實驗中，加載了0.2-50µg的HeLa裂解物，以檢測靶標蛋白STAT3與內(nèi)參對照GAPDH和總蛋白膜染色的性能。盡管Total-PVDF膜染色線性最高至50μg裂解物，但這顯然不是靶標蛋白STAT3加載的理想上樣量，因為信號在12.5μg以上不再線性。上樣控制GAPDH的歸一化提出了一個嚴重的問題，因為它在裂解物的濃度低于1µg時呈線性，因此其定量用途非常有限。

一般而言，我們建議不要加入超過20µg的裂解物，因為這通常會導(dǎo)致蛋白定量方面的問題。為了獲得最佳的熒光定量Western印跡，不要忘記應(yīng)用適當(dāng)?shù)臍w一化策略并加載適量的蛋白。

Azure Imager多功能分子成像系統(tǒng)

☑   雙激光近紅外成像：激發(fā)強度大、信噪比高、光泄漏少。

☑   RGB可見熒光多功能檢測：可進行小鼠成像、轉(zhuǎn)基因植物篩選、模式生物斑馬魚成像、培養(yǎng)皿成像等。

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☑   高靈敏化學(xué)發(fā)光和彩色Marker成像。

☑   彩色蛋白膠和核酸膠成像。

參考文獻：

1. Collecting and presenting data. The Journal of Biological Chemistry.

website.:http://jbcresources.asbmb.org/collecting-and-presenting-data#blot. Accessed February 4, 2019.

2. Fosang AJ and Colbran RJ. Transparency Is the Key to Quality. J Biol Chem. Dec. 11 2015. 290(50). 29692–29694. PMCID: PMC4705984.