蛋白純化系統(tǒng)化常見(jiàn)問(wèn)題總結(jié)
使用Blupadstart蛋白純化系統(tǒng)過(guò)程中常遇見(jiàn)一些問(wèn)題，這里整理了以下幾個(gè)蛋白純化實(shí)驗(yàn)中遇見(jiàn)的問(wèn)題及其解決方案。
1)我現(xiàn)在手頭有個(gè)融合蛋白，純化的時(shí)候用助溶劑溶解后做了GST親和層析，之后用蛋白酶切割后卻發(fā)現(xiàn)目的蛋白沒(méi)有活性。
請(qǐng)問(wèn)有哪些可能會(huì)出現(xiàn)這種原因?怎么解決?測(cè)過(guò)基因序列，沒(méi)有問(wèn)題。細(xì)胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶劑提取后，可以用GST做親和層析，但效率只有50%～60%左右。洗脫完融合蛋白不需要助溶劑，但這樣的條件下切割完后目的蛋白會(huì)沉淀，我用0.5%CHAPS助溶可勉強(qiáng)溶解部分，目的蛋白疏水性比較強(qiáng)。
既然是疏水性很強(qiáng)你可以加點(diǎn)甘油或者乙二醇降低極性，這樣溶解就會(huì)好得多，此外你也直接加2%的PEG這樣也降低極性，同時(shí)保護(hù)你的蛋白，你再做純化就可以了，我以前遇到這樣的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG-5000，這樣的情況下蛋白還是活性回收率很高，我覺(jué)得那些表面活性劑能不用還是不用的好，你失去活性你可以監(jiān)測(cè)一下提取，純化，酶切到底哪里失去了活性，這樣更容易解決你的問(wèn)題。還有注意緩沖液PH值，看看改變它對(duì)溶解度有沒(méi)有影響。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的濃度降低點(diǎn)，這也是個(gè)辦法。
2)請(qǐng)問(wèn)有沒(méi)有合成過(guò)配體為FMN的親和膠?
親和的填料合成過(guò)20來(lái)種，你是希望用它來(lái)純化某種脫氫酶嗎，我看FMN可偶聯(lián)的有限，倒是FAD有活潑的氨基好偶聯(lián)，何況它們幾乎是同一個(gè)輔酶，你是不是考慮把FAD連上去。當(dāng)然FMN的結(jié)構(gòu)上也有個(gè)仲胺，可以偶聯(lián)到帶長(zhǎng)手臂的環(huán)氧活化的填料上，而溴化氰活化或別的活化的介質(zhì)都不大好，因此我覺(jué)得這個(gè)沒(méi)有什么問(wèn)題。
此外如果是以FMN為輔酶的，那我還可以建議你試試藍(lán)色瓊脂糖凝膠，因?yàn)樗呐浠慕Y(jié)構(gòu)和FMN的三個(gè)環(huán)很相似，它能純化不少脫氫酶和激酶。
相應(yīng)的偶聯(lián)的材料，要自己合成親和填料，有很多公司都提供活化好的介質(zhì)，自己偶聯(lián)就可以，其中比較常用的有啟維益成公司的溴化氰瓊脂糖凝膠，環(huán)氧瓊脂糖凝膠，氨基瓊脂糖凝膠，羧基瓊脂糖凝膠，活化酯瓊脂糖凝膠，以及巰基瓊脂糖凝膠等，但是如果是小分子的配基*好選擇有3-10碳作為手臂的活化介質(zhì)為好，此外也曾經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)固定輔酶時(shí)，偶聯(lián)位置不同，選擇性有差別，因此你可以選擇自己適合的活化介質(zhì)。
不同的活化的介質(zhì)對(duì)偶聯(lián)的配基有不同的要求，所以要先對(duì)自己的配基有一個(gè)清楚的了解就可以選擇合適的活化介質(zhì)。
我一般在合成的時(shí)候大多選擇環(huán)氧瓊脂糖凝膠，它能應(yīng)用的范圍廣氨基巰基羥基都可以，而且合成的介質(zhì)剛性好，非特異吸附少，所以不需要特殊處理未反應(yīng)基團(tuán)。此外鍵合的鍵很穩(wěn)定，配基脫落少。我覺(jué)得是不錯(cuò)的選擇。
包涵體的蛋白復(fù)性做得不多，但是我記得有個(gè)哥們說(shuō)*管用的辦法也是*簡(jiǎn)單的方法，他說(shuō)在復(fù)性的時(shí)候盡量別想什么太高難的技術(shù)，那些時(shí)髦但不一定好用，常用的有透析復(fù)性，稀釋復(fù)性，包括國(guó)外的專家也這么說(shuō)。我覺(jué)得有時(shí)候開(kāi)始摸不出來(lái)未必就是方法不行，關(guān)鍵要經(jīng)常改變條件。
層析復(fù)性很時(shí)髦，但是真正能用的不是很多，我覺(jué)得蛋白這東西難就在于大多都不相同，所以關(guān)鍵要多看文獻(xiàn)，多琢磨自己蛋白的特性，多嘗試。
3)Sephadex G-25(medium)柱脫鹽時(shí)，鹽濃度太高對(duì)柱效有影響嗎?若有，一般對(duì)鹽濃度限度如何?
大家別客氣，除鹽對(duì)于濃度應(yīng)該也是有一定的限制的，同樣的樣品鹽濃度高的自然要比濃度低的要在柱子上走的峰要寬些，相對(duì)需要的柱子的分辨率也要高點(diǎn)，但是在正常的范圍如1-2M應(yīng)該影響不大，不過(guò)要除得很干凈還是盡量少上點(diǎn)樣品，我覺(jué)得上樣的體積畢竟比濃度的影響更大。
4)我的蛋白17kd左右，能跟肝素親和，一般用離子交換和親和層析純化，現(xiàn)在我用聚乙二醇修飾它，分子量增加5000左右，修飾率不可能達(dá)到100%，請(qǐng)問(wèn)修飾后能用什么純化方法可以把修飾的和未經(jīng)修飾的分開(kāi)?(當(dāng)然修飾后還殘留有聚乙二醇，這個(gè)小分子也要除掉)
他們大多用凝膠過(guò)濾，我覺(jué)得這也不錯(cuò)的做法，畢竟PEG是鏈狀的分子，在柱子上和普通蛋白行為不一樣，修飾度越高那么出峰也越后，因此你的蛋白選擇sephadex G50試試，它的范圍在1000-30000，應(yīng)該是不錯(cuò)的選擇。此外PEG是個(gè)疏水性的鏈，修飾后的蛋白疏水性增強(qiáng)，修飾度越高，疏水性越強(qiáng)，可以用這個(gè)原理分離。離子交換也可以選擇，因?yàn)橥瑯拥览恚揎椂仍礁�，電荷被屏蔽也越多，電荷也越少，因此�?yīng)該修飾度越高越先出。親和也離子交換一樣的道理，你可以試試，你手頭的親和能不能分開(kāi)，你在這幾個(gè)方法里選擇看哪個(gè)更經(jīng)濟(jì)好用就可以。
5)我有個(gè)問(wèn)題困繞很久，從**中提取酶，好像用常規(guī)的方法(超聲波破壁，緩沖液提取)，總是拿不到我要的蛋白。是不是這種蛋白也是疏水性較強(qiáng)，需要加助溶劑才能提取出來(lái)?另外，我是不是也可以加點(diǎn)甘油或者PEG來(lái)提取?
其實(shí)這個(gè)問(wèn)題我覺(jué)得是這樣的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目標(biāo)蛋白的分子量你是應(yīng)該知道的，那么跑電泳先看它到底是在上清還是沉淀里，剩下的問(wèn)題你再解決如何提取。
對(duì)于不同的酶要看酶穩(wěn)定如何，你可以用不同的PH去提取，我曾經(jīng)提取一個(gè)酶用水就是提取不出來(lái)，需要用鹽才能提取出來(lái)，多試試，設(shè)計(jì)個(gè)方案，這樣才能解決問(wèn)題，所以不一定加甘油就管用，你還得注意破碎本身會(huì)不會(huì)有問(wèn)題，倒回去做做也許能找到真正的原因。有什么問(wèn)題繼續(xù)探討。
6)HPLC是用來(lái)分析檢測(cè)或分離純化?
如果可以用來(lái)純化，上樣量那么小有什么意義呢?
如果是用來(lái)分析檢測(cè)，怎樣指導(dǎo)以后的分離純化工作呢?
HPLC既可以做分析也可以做制備，純化上樣量小，這樣分離效果好，就可能得到很純的物質(zhì)，同時(shí)配合質(zhì)譜等就可以得到很多單一蛋白的特性包括序列等，這些純度高的組分是用一般的純化方法做不到的。HPLC重現(xiàn)性好，定量準(zhǔn)確，所以也可以用于定量和定性，是分析中不可缺少的工具。
分析出來(lái)后如果這個(gè)物質(zhì)很穩(wěn)定，直接線性放大就可以做大規(guī)模的制備，因此摸好了分析的條件也就相應(yīng)有了制備的條件。
1)我現(xiàn)在手頭有個(gè)融合蛋白，純化的時(shí)候用助溶劑溶解后做了GST親和層析，之后用蛋白酶切割后卻發(fā)現(xiàn)目的蛋白沒(méi)有活性。
請(qǐng)問(wèn)有哪些可能會(huì)出現(xiàn)這種原因?怎么解決?測(cè)過(guò)基因序列，沒(méi)有問(wèn)題。細(xì)胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶劑提取后，可以用GST做親和層析，但效率只有50%～60%左右。洗脫完融合蛋白不需要助溶劑，但這樣的條件下切割完后目的蛋白會(huì)沉淀，我用0.5%CHAPS助溶可勉強(qiáng)溶解部分，目的蛋白疏水性比較強(qiáng)。
既然是疏水性很強(qiáng)你可以加點(diǎn)甘油或者乙二醇降低極性，這樣溶解就會(huì)好得多，此外你也直接加2%的PEG這樣也降低極性，同時(shí)保護(hù)你的蛋白，你再做純化就可以了，我以前遇到這樣的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG-5000，這樣的情況下蛋白還是活性回收率很高，我覺(jué)得那些表面活性劑能不用還是不用的好，你失去活性你可以監(jiān)測(cè)一下提取，純化，酶切到底哪里失去了活性，這樣更容易解決你的問(wèn)題。還有注意緩沖液PH值，看看改變它對(duì)溶解度有沒(méi)有影響。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的濃度降低點(diǎn)，這也是個(gè)辦法。
2)請(qǐng)問(wèn)有沒(méi)有合成過(guò)配體為FMN的親和膠?
親和的填料合成過(guò)20來(lái)種，你是希望用它來(lái)純化某種脫氫酶嗎，我看FMN可偶聯(lián)的有限，倒是FAD有活潑的氨基好偶聯(lián)，何況它們幾乎是同一個(gè)輔酶，你是不是考慮把FAD連上去。當(dāng)然FMN的結(jié)構(gòu)上也有個(gè)仲胺，可以偶聯(lián)到帶長(zhǎng)手臂的環(huán)氧活化的填料上，而溴化氰活化或別的活化的介質(zhì)都不大好，因此我覺(jué)得這個(gè)沒(méi)有什么問(wèn)題。
此外如果是以FMN為輔酶的，那我還可以建議你試試藍(lán)色瓊脂糖凝膠，因?yàn)樗呐浠慕Y(jié)構(gòu)和FMN的三個(gè)環(huán)很相似，它能純化不少脫氫酶和激酶。
相應(yīng)的偶聯(lián)的材料，要自己合成親和填料，有很多公司都提供活化好的介質(zhì)，自己偶聯(lián)就可以，其中比較常用的有啟維益成公司的溴化氰瓊脂糖凝膠，環(huán)氧瓊脂糖凝膠，氨基瓊脂糖凝膠，羧基瓊脂糖凝膠，活化酯瓊脂糖凝膠，以及巰基瓊脂糖凝膠等，但是如果是小分子的配基*好選擇有3-10碳作為手臂的活化介質(zhì)為好，此外也曾經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)固定輔酶時(shí)，偶聯(lián)位置不同，選擇性有差別，因此你可以選擇自己適合的活化介質(zhì)。
不同的活化的介質(zhì)對(duì)偶聯(lián)的配基有不同的要求，所以要先對(duì)自己的配基有一個(gè)清楚的了解就可以選擇合適的活化介質(zhì)。
我一般在合成的時(shí)候大多選擇環(huán)氧瓊脂糖凝膠，它能應(yīng)用的范圍廣氨基巰基羥基都可以，而且合成的介質(zhì)剛性好，非特異吸附少，所以不需要特殊處理未反應(yīng)基團(tuán)。此外鍵合的鍵很穩(wěn)定，配基脫落少。我覺(jué)得是不錯(cuò)的選擇。
包涵體的蛋白復(fù)性做得不多，但是我記得有個(gè)哥們說(shuō)*管用的辦法也是*簡(jiǎn)單的方法，他說(shuō)在復(fù)性的時(shí)候盡量別想什么太高難的技術(shù)，那些時(shí)髦但不一定好用，常用的有透析復(fù)性，稀釋復(fù)性，包括國(guó)外的專家也這么說(shuō)。我覺(jué)得有時(shí)候開(kāi)始摸不出來(lái)未必就是方法不行，關(guān)鍵要經(jīng)常改變條件。
層析復(fù)性很時(shí)髦，但是真正能用的不是很多，我覺(jué)得蛋白這東西難就在于大多都不相同，所以關(guān)鍵要多看文獻(xiàn)，多琢磨自己蛋白的特性，多嘗試。
3)Sephadex G-25(medium)柱脫鹽時(shí)，鹽濃度太高對(duì)柱效有影響嗎?若有，一般對(duì)鹽濃度限度如何?
大家別客氣，除鹽對(duì)于濃度應(yīng)該也是有一定的限制的，同樣的樣品鹽濃度高的自然要比濃度低的要在柱子上走的峰要寬些，相對(duì)需要的柱子的分辨率也要高點(diǎn)，但是在正常的范圍如1-2M應(yīng)該影響不大，不過(guò)要除得很干凈還是盡量少上點(diǎn)樣品，我覺(jué)得上樣的體積畢竟比濃度的影響更大。
4)我的蛋白17kd左右，能跟肝素親和，一般用離子交換和親和層析純化，現(xiàn)在我用聚乙二醇修飾它，分子量增加5000左右，修飾率不可能達(dá)到100%，請(qǐng)問(wèn)修飾后能用什么純化方法可以把修飾的和未經(jīng)修飾的分開(kāi)?(當(dāng)然修飾后還殘留有聚乙二醇，這個(gè)小分子也要除掉)
他們大多用凝膠過(guò)濾，我覺(jué)得這也不錯(cuò)的做法，畢竟PEG是鏈狀的分子，在柱子上和普通蛋白行為不一樣，修飾度越高那么出峰也越后，因此你的蛋白選擇sephadex G50試試，它的范圍在1000-30000，應(yīng)該是不錯(cuò)的選擇。此外PEG是個(gè)疏水性的鏈，修飾后的蛋白疏水性增強(qiáng)，修飾度越高，疏水性越強(qiáng)，可以用這個(gè)原理分離。離子交換也可以選擇，因?yàn)橥瑯拥览恚揎椂仍礁�，電荷被屏蔽也越多，電荷也越少，因此�?yīng)該修飾度越高越先出。親和也離子交換一樣的道理，你可以試試，你手頭的親和能不能分開(kāi)，你在這幾個(gè)方法里選擇看哪個(gè)更經(jīng)濟(jì)好用就可以。
5)我有個(gè)問(wèn)題困繞很久，從**中提取酶，好像用常規(guī)的方法(超聲波破壁，緩沖液提取)，總是拿不到我要的蛋白。是不是這種蛋白也是疏水性較強(qiáng)，需要加助溶劑才能提取出來(lái)?另外，我是不是也可以加點(diǎn)甘油或者PEG來(lái)提取?
其實(shí)這個(gè)問(wèn)題我覺(jué)得是這樣的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目標(biāo)蛋白的分子量你是應(yīng)該知道的，那么跑電泳先看它到底是在上清還是沉淀里，剩下的問(wèn)題你再解決如何提取。
對(duì)于不同的酶要看酶穩(wěn)定如何，你可以用不同的PH去提取，我曾經(jīng)提取一個(gè)酶用水就是提取不出來(lái)，需要用鹽才能提取出來(lái)，多試試，設(shè)計(jì)個(gè)方案，這樣才能解決問(wèn)題，所以不一定加甘油就管用，你還得注意破碎本身會(huì)不會(huì)有問(wèn)題，倒回去做做也許能找到真正的原因。有什么問(wèn)題繼續(xù)探討。
6)HPLC是用來(lái)分析檢測(cè)或分離純化?
如果可以用來(lái)純化，上樣量那么小有什么意義呢?
如果是用來(lái)分析檢測(cè)，怎樣指導(dǎo)以后的分離純化工作呢?
HPLC既可以做分析也可以做制備，純化上樣量小，這樣分離效果好，就可能得到很純的物質(zhì)，同時(shí)配合質(zhì)譜等就可以得到很多單一蛋白的特性包括序列等，這些純度高的組分是用一般的純化方法做不到的。HPLC重現(xiàn)性好，定量準(zhǔn)確，所以也可以用于定量和定性，是分析中不可缺少的工具。
分析出來(lái)后如果這個(gè)物質(zhì)很穩(wěn)定，直接線性放大就可以做大規(guī)模的制備，因此摸好了分析的條件也就相應(yīng)有了制備的條件。
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