GEN eBook | 病毒學(xué)/病毒免疫學(xué)最新研究與開發(fā)策略

GEN eBook包含一系列文章和研究，重點(diǎn)關(guān)注創(chuàng)新的研究和開發(fā)策略，讓科學(xué)家們能夠充分利用新方法和獲得的新見解，解決病毒生物學(xué)的復(fù)雜問題，從而加快發(fā)現(xiàn)和開發(fā)抗病毒感染新疫苗的速度。
 
   
·  流感疫苗可預(yù)防患有鐮刀形細(xì)胞癥小鼠的H1N1感染
·  細(xì)胞系中的微粒釋放及其抗流感活性
·  接受腎透析的HIV陽性患者在接種水痘-帶狀皰疹病毒疫苗后的血清學(xué)和T細(xì)胞反應(yīng)
·  使用新型多重T細(xì)胞活化試驗(yàn)進(jìn)行的激酶抑制劑表型篩選
·  對(duì)四價(jià)丙型肝炎病毒樣顆粒疫苗佐以Toll樣受體2型激動(dòng)劑的抗體應(yīng)答
自身免疫性疾病的一個(gè)主要原因是某些干擾導(dǎo)致TCR信號(hào)增強(qiáng)和T細(xì)胞過度激活。例如，一些遺傳缺陷、突變和其他機(jī)制導(dǎo)致T細(xì)胞激酶活性增強(qiáng)，從而參與許多自身免疫病的病理發(fā)生，使它們成為有吸引力的T細(xì)胞活化抑制劑靶點(diǎn)。
 
目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的激酶抑制劑（KI）有37種，主要用于腫瘤治療，此外約有250種正在臨床試驗(yàn)中。專門針對(duì)T細(xì)胞激活早期信號(hào)事件的KI藥物，已成為治療自身免疫性疾病的新焦點(diǎn)，最近FDA已批準(zhǔn)KI治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
 
在開發(fā)調(diào)節(jié)TCR活性的藥物和療法時(shí)，需要對(duì)細(xì)胞功能和健康進(jìn)行分析。為了滿足快速監(jiān)測T細(xì)胞功能的需要，我們采用高通量流式細(xì)胞術(shù)開發(fā)了一種優(yōu)化的、高內(nèi)涵的、多重性檢測方法來分析T細(xì)胞激活，可用于同時(shí)評(píng)估T細(xì)胞表型、T細(xì)胞激活標(biāo)記物、細(xì)胞增殖、細(xì)胞活力及其分泌的細(xì)胞因子定量，并適用于96孔或384孔板的高通量篩選需求。
  采用這種方法快速篩選了152個(gè)KI小分子，以驗(yàn)證其對(duì)人原代T細(xì)胞激活的抑制能力。樣本來自人外周血PBMC，采用抗CD3/CD28微球刺激。
  在基于流式細(xì)胞術(shù)的篩選中，我們將以下檢測在一次實(shí)驗(yàn)中完成，節(jié)省時(shí)間，同時(shí)獲得豐富的樣本信息，以便做出綜合性決策：
 

• 檢測T細(xì)胞活化早、中、晚期的活化標(biāo)志，分別是CD69、CD25和HLA-DR
• 評(píng)估CD4和CD8細(xì)胞的增殖水平
• 分析CD4和CD8細(xì)胞的活性
• 定量細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子，以評(píng)估T細(xì)胞功能

 
我們將這些分析的指標(biāo)作為小分子庫的篩選標(biāo)準(zhǔn)，用系統(tǒng)內(nèi)置的篩選工具（Profile Map）進(jìn)行篩選。
如下圖所示，左邊面板（圖A）顯示了篩選中整合的11個(gè)參數(shù)，及每個(gè)指標(biāo)的用戶定義閾值。
 
通過這種篩選方法，我們鑒定出27種不同的KI，它們抑制所有的T細(xì)胞激活標(biāo)記物及細(xì)胞因子分泌（如圖B所示）。
   圖C的折線圖對(duì)所有hits命中和抑制程度進(jìn)行了排序，對(duì)每個(gè)指標(biāo)提供了簡單的可視化呈現(xiàn)。例如，一些KI處理完全抑制所有激活標(biāo)志，而其他化合物對(duì)某些特定的表型標(biāo)志或細(xì)胞因子影響更大。
 
此外，本次實(shí)驗(yàn)還用不同濃度的化合物（20uM - 20nM）處理細(xì)胞，以獲得抑制濃度曲線及IC50。這些數(shù)據(jù)顯示這些KI具有不同的MOA特性。
  這種基于流式細(xì)胞術(shù)的高通量篩選方法，既可用于抗體和小分子開發(fā)流程中的初篩，也可用于二次表型篩選。此外，T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子檢測還可用于腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域的功能研究，對(duì)細(xì)胞制造過程中的T細(xì)胞進(jìn)行表征。