MIQE中核酸質量控制環(huán)節(jié)的操作簡易說明

RNA樣本：

比較不同的樣本時，應保證各樣本中含有大致相同量的RNA，因此需要對所提取的RNA進行定量。常用的定量方法包括：分光光度法、熒光染料檢測、瓊脂糖凝膠電泳、毛細管凝膠電泳和3'：5'分析。

由于不同的方法產生不同的結果，因此直接比較不同方法的測定結果是很不科學的。建議使用熒光RNA結合染料(如RiboGreen)定量RNA，此法在檢測低濃度目標時表現(xiàn)出最佳性能。任何情況下都建議僅使用單一方法測定所有樣本并報告相關信息。檢測和報告全基因組DNA的污染程度，并記錄能夠耐受的這些污染的臨界值標準也是非常重要的。另外還應重點報告RNA樣品是否已經(jīng)過RNA酶處理(包括酶的類型及反應條件)，并報告每個核酸目標在陽性質控品和無反轉錄質控品存在下Cq值的比較結果。

此外，還需對RNA模板進行質量評價。除非提取的總RNA量太低以至于不允許進行質量評價。但產生這種特殊情況是有條件的：從單細胞、血漿、其他無細胞體液、一些激光捕獲樣品或澄清組織培養(yǎng)基中提取RNA，或提取操作和RT-qPCR測定通過一個連續(xù)的、單管實驗完成。還需要注意的關鍵信息包括RNA的數(shù)量、完整度、不存在反轉錄或PCR抑制劑。值得注意的是RNA在體內的降解非常明顯，這是mRNA為應對環(huán)境刺激而進行的自然調節(jié)。研究人員尚不能控制RNA的降解，其表現(xiàn)之一是即使高質量的RNA樣品也顯示出不同的mRNA降解差異。

A260/A280的吸收度比值必須在中性pH的緩沖鹽條件下測定，但如果進行核酸定量分析，特別是測定細胞mRNA濃度微小(<10倍)的差異時，單單提供以上測量信息是遠遠不夠的。還要提供RNA純度的信息，因為DNA或酚的存在會改變此比值。另外，至少應該提供凝膠電泳的證據(jù)，如果可以最好提供rRNA的微流控分析結果或參考基因或靶基因的3'：5'的完整度檢測結果。使用Bioanalyzer或Experion系統(tǒng)計算RNA完整度或RNA質量指標數(shù)值的優(yōu)勢在于，這種測定提供了RNA樣品總體狀況的定量信息。但需要注意的是這些數(shù)值只是與rRNA的質量有關，而不是測定質量的絕對值。3'：5'分析方法要求兩種測定的PCR效率幾乎相同，而且受抑制的程度不能有差異。此法對于足以產生可靠結果的RNA質量的閾值標準的界定也是有必要的。理想情況下，測定方法應該以一組“完整性參考基因”為目標，可能沒有內含子，3'：5'的閾值比約為0.2-5，顯然，我們需要進一步的研究以建立一個普遍適用的、符合成本效益的、簡單的程序來評價RNA的完整度。

建議使用稀釋的樣本或常用的抑制方法如SPUD法檢查反轉錄活性或PCR的抑制作用。如果RNA樣本發(fā)生部分降解，這個信息一定要報道，這是至關重要的，因為這樣可能會使方法檢測低濃度轉錄水平的靈敏度降低，而且由于降解引起的轉錄水平的相對差異可能會產生不正確的目標比值結果。

DNA樣本：

一般情況下，DNA不會產生很大的降解問題。然而，在法醫(yī)學領域，DNA降解程度的評估是一項很重要的工作，例如在犯罪現(xiàn)場惡劣的環(huán)境條件下或大規(guī)模災害或涉及多個失蹤人員的案件中，DNA的化學結構可能已經(jīng)發(fā)生降解。PCR分析的小規(guī)模擴增有助于最大限度地減少檢測有關的問題，但目前已開發(fā)的方法主要用于DNA質量的定量測定，我們應該考慮將這些方法用于上述的特定目的抑制劑的存在會給測定結果帶來變異，因此文章中必須說明是否存在抑制劑，以確保不影響DNA的測定結果，如病原體檢測和相應的定量。在樣本中加入陽性質控品的方法可用于檢測抑制作用，但不同PCR反應可能會受到不同程度的抑制，這些抑制劑往往是在核酸提取物中與DNA共純化的物質。因此，常規(guī)實驗中最好將核酸樣本稀釋，以證明觀察到的Cq或拷貝數(shù)的減少與預期結果是一致的，并報告這些數(shù)據(jù)。(資料來源：2020版MIQE指南)

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