實驗手冊︱行為學成癮系列（一）

01.準備

• Article（文章）Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behaviorIncubation of Cocaine Craving After Intermittent-Access Self-administration: Sex Differences and Estrous Cycle
• Materials and Reagents（材料與試劑）實驗分組：對照組，自主給藥時給生理鹽水。實驗組，自主給藥時給受試藥物。
• Equipment （儀器設(shè)備）
  Lafayette斯金納箱-自主給藥系統(tǒng)

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02.Principle（原理）

自主給藥系統(tǒng)（自身給藥實驗）是行為藥理研究的常用方法，它利用某些藥物的正性強化作用，通過一定條件控制，使動物建立起行為與獎賞之間的聯(lián)系，從而模擬人類藥物濫用的一些情況。

1954年，詹姆斯·奧爾茲和皮特·米爾納最先認識到腦內(nèi)存在獎賞系統(tǒng)并運用動物自主給藥系統(tǒng)：按壓按鈕使大鼠接受大腦中的對特定部位短暫的電刺激。

獎賞環(huán)路的分類

正性獎賞環(huán)路（增大獎賞效應）和負性獎賞環(huán)路（抑制獎賞效應），此處主要介紹正反饋自主給藥實驗。

1、正性獎賞環(huán)路

中腦邊緣多巴胺（Dopamine，DA）系統(tǒng)是獎賞環(huán)路的中心。該系統(tǒng)主要起源于兩個腦區(qū)：中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）和黑質(zhì)致密部（Substantial nigra pars compacta，SNpc）。VTA多巴胺能神經(jīng)元主要投射到伏隔核（Nucleus Accumbens，NAcc）、內(nèi)側(cè)前額葉皮層（Medial Prefrontal Cortex）和基底外側(cè)杏仁核（basolateral nucleus of amygdale，）。此外，基底外側(cè)杏仁核的谷氨酸能神經(jīng)元可以通過 NAcc 間接投射到VTA。內(nèi)側(cè)前額葉皮層也能投射到VTA，這些腦區(qū)共同構(gòu)成了正性獎賞環(huán)路。其中，VTA富含多巴胺能神經(jīng)元，是調(diào)控獎賞功能的主要區(qū)域，這就是獎勵對動物神經(jīng)內(nèi)分泌的作用的體現(xiàn)之一。

2、負性獎賞環(huán)路

研究表明LHb接收來自蒼白球、下丘腦和前扣帶回等腦區(qū)的輸入，然后投射到VTA的多巴胺能神經(jīng)元。這些通路共同構(gòu)成了負性獎賞環(huán)路。外側(cè)韁核（lateral habenula，LHb）是負性獎賞環(huán)路的主要區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，向猴子進行厭惡刺激會強烈激活LHb神經(jīng)元；用光遺傳方法激活大鼠腳內(nèi)核到LHb的輸入會使得大鼠厭惡、逃避所探索的環(huán)境。這表明在嚙齒類動物和非人靈長類動物中LHb均參與處理和編碼厭惡信息，提示我們可通過激活LHb來抑制獎賞效應，從而治療藥物成癮、抑制動物刻板行為的目的。

03.Procedure （方法步驟）

適應期

1. handle動物3-7天，使動物適應被抓取，不會產(chǎn)生過大的應激反應

學習期

1. 斯金納箱預設(shè)程序，壓桿一次給予糖水獎勵（比較簡單，無需禁食），每個實驗周期設(shè)為10分鐘或壓桿20次；
2. 將動物放入斯金納箱進行學習，每天1次；
3. 動物10分鐘內(nèi)按壓壓桿20次，且按壓后進入食槽獲得獎勵概率大于85%，穩(wěn)定重復2天，視為學會壓桿；
4. 當有滿足分組數(shù)量足夠多的動物學會壓桿操作后（每組額外預留多只動物，后續(xù)仍會有淘汰階段），結(jié)束學習期，淘汰沒有學會壓桿的動物（淘汰動物可以用于其它實驗）。

實驗期

1. 對所有學會壓桿的動物進行靜脈埋管；
2. 埋管后重復一天斯金納箱學習實驗，剔除埋管導致壓桿行為喪失的動物；
3. 將剩余動物按照實驗需要進行分組；
4. 斯金納箱預設(shè)程序 ，壓桿一次給予藥物注射一定時間，藥物依據(jù)分組不同而不同。每個實驗周期設(shè)為10分鐘；
5. 將動物放入斯金納箱中進行實驗，每天1次，共計2天。

04.檢測數(shù)據(jù)

實驗期動物按壓壓桿的次數(shù)。

正性獎賞環(huán)路實驗中，對照組一般注射溶劑或者生理鹽水等動物不會產(chǎn)生成癮反應的液體，動物會在實驗過程中發(fā)生行為消退，兩次實驗過程中按壓壓桿次數(shù)會減少。若藥物對于動物有成癮作用，則動物會視藥物注射為獎勵，壓桿操作則不會因為消退而導致減少，甚至可能會產(chǎn)生更多次的按壓行為。負性獎賞環(huán)路實驗中，對照組一般注射容易讓動物產(chǎn)生成癮反應的液體，從而動物在實驗過程中不易發(fā)生行為消退，兩次實驗過程中壓桿次數(shù)不會減少，甚至會增多。若受試藥物對此有抑制作用，則動物會發(fā)生行為消退，兩次實驗過程中按壓壓桿次數(shù)會減少。

05.數(shù)據(jù)分析方法

*注意事項

1. 觸鼻和壓桿是兩種經(jīng)典斯金納箱常用響應方式。之所以選擇壓桿而不是觸鼻進行實驗，是因為觸鼻是動物本來就存在的一種行為，造模相對會比較類似于經(jīng)典條件反射。
2. 實驗期應對動物食槽進行遮擋，避免動物進入食槽時可能會扯掉給藥導管。
3. 如果需要同時評估藥物除了成癮外的其它功能，如對動物記憶、注意力的作用等，則需使用更為復雜的斯金納箱應用程序來進行實驗，實驗周期也會有所延長。若受試藥物為興奮劑類型的藥物，動物可能會進入過度亢奮的狀態(tài)，產(chǎn)生如四處亂跳等亢奮行為，會對壓桿操作有一定的影響。此時建議結(jié)合視頻錄制來觀察動物狀態(tài)，確定藥物是否有成癮傾向

 

 

01.準備

• Article（文章）Prefrontal cortical regulation of brainwide circuit dynamics and reward-related behaviorChemogenetic inhibition of lateral habenula projections to the dorsal raphe nucleus reduces passive coping and perseverative reward seeking in rats
• Materials and Reagents（材料與試劑）糖精、清潔水、千分秤
• Equipment （儀器設(shè)備）Lickometer舔舐行為測試系統(tǒng)

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02.Principle（原理）

糖水偏好測試是一項簡單的任務，用于評估嚙齒動物模型中的動機、抑郁(和無快感)及相關(guān)情緒狀態(tài)，也用于更復雜的模型，如產(chǎn)后抑郁癥和停藥等。

1981年，Katz等人首次在抑郁大鼠造模過程中發(fā)現(xiàn)，應激后的大鼠蔗糖和糖精水的消耗減少達50%，并進一步發(fā)現(xiàn)三環(huán)類抗抑郁藥丙咪嗪可顯著增加模型組大鼠糖水的消耗量，隨后Willner等使用糖水偏好實驗對CUMS（Chronic unpredictable mild stress，慢性輕度不可預見刺激應激模型）大鼠進行評價，發(fā)現(xiàn)隨著應激時間的延長和應激強度增加，模型大鼠的糖水消耗率明顯下降，且該結(jié)果可被抗抑郁藥物去甲丙咪嗪改善。該實驗同時排除了大鼠糖水消耗減少是出于熱量調(diào)節(jié)失調(diào)或應激后血糖升髙引起糖水攝入量降低的猜想。此重要發(fā)現(xiàn)說明了內(nèi)源性抑郁癥的核心特征是獎勵機制缺陷和快感缺乏�，F(xiàn)代研究表明，作為中腦“獎勵中心”的單胺核團，多巴胺系統(tǒng)邊緣通路與獎賞機制有關(guān)叫外側(cè)韁核則是大腦的“反獎勵中樞”，其簇狀放電方式增強了對腹側(cè)被蓋區(qū)與中縫背核的抑制，進而導致了快感缺失與行為絕望，是抑郁癥發(fā)生的充分條件。

03.Protocol （方法步驟）

1. Day1-3：適應實驗房間（單籠飼養(yǎng)，雙飲水瓶均裝潔凈自來水，自由飲水攝食）；Handle（5min/天將動物放在手上輕柔把玩）（測試開始于測試結(jié)束時均要稱量記錄水瓶重量）；
2. Day4：雙瓶均為水（測試開始與測試結(jié)束時均要稱量記錄水瓶重量，剔除有飲水偏好的動物）；
3. Day5：雙瓶均為1-2%糖水（測試開始與測試結(jié)束時均要稱量記錄水瓶重量）；
4. Day6：8am-2pm進行實驗，動物可自由攝取兩瓶水/糖水（測試開始與測試結(jié)束時均要稱量記錄水瓶重量）。

04.數(shù)據(jù)分析方法

糖水比例（%）=【糖水攝入量/（糖水攝入量+水攝入量）】*100%同時也可以分析舔舐次數(shù)變化。

*注意事項

1. 水瓶滴漏：避免水瓶地漏，造成稱量重量出現(xiàn)偏差
2. 品系差異：如，李斯特（Lister）帶帽的大鼠在濃度為1％時顯示出明顯的蔗糖偏愛，而威斯塔（Wistar）大鼠則沒有。與C57BL / 6J小鼠相比，129P3 / J小鼠對蔗糖或麥芽糊精加糖溶液的偏愛性較低
3. 性別差異：如，Wistar Kyoto雄性大鼠的蔗糖偏愛率低于雌性。京都Wistar雄性大鼠表現(xiàn)出應激誘導的蔗糖偏愛損失，而雌性則沒有。相反，雄性和雌性Sprague Dawley大鼠在慢性輕度應激后均表現(xiàn)出蔗糖偏愛的降低