iTRAQ/TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組研究的應(yīng)用
標(biāo)記試劑分為兩種：iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)，是分別由美國AB Sciex公司和Thermo公司研發(fā)的多肽體外標(biāo)記定量技術(shù)，采用多種同位素的標(biāo)簽，可與氨基（包括氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈氨基）反應(yīng)實現(xiàn)連接，通過高精度質(zhì)譜分析，同時實現(xiàn)多個樣本蛋白組的定性和定量。
1.標(biāo)記試劑與原理
Reporter：報告離子基團，用來對不同肽段進行定量；
Balance：平衡基團，保證同一肽段標(biāo)記后母離子質(zhì)量一致；
Peptide Reactive Group：肽反應(yīng)基團，與氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈氨基反應(yīng)連接。
2.標(biāo)記試劑盒種類
3.iTRAQ/TMT技術(shù)研究流程
4.生信分析展示
5.技術(shù)優(yōu)勢
- 適用范圍廣：可檢測到的蛋白除了胞漿蛋白外，還有線粒體蛋白、膜蛋白和核蛋白。也能對任何類型的蛋白質(zhì)進行鑒定，包括高分子量，酸性，堿性蛋白質(zhì)；
- 高通量：一次可以實現(xiàn)多個樣品的定性定量分析，特別適用于采用多種處理方式或來自多個處理時間的樣本的差異蛋白分析；
- 結(jié)果可靠：基于高靈敏度和高分辨的串聯(lián)質(zhì)譜方法，定性與定量同步進行，同時得出定性和定量結(jié)果，重復(fù)樣品間的蛋白表達量相關(guān)性高；
- 靈敏度高：分級分離，降低樣品復(fù)雜度，相比凝膠電泳觀測到的蛋白變化在2倍以上，iTRAQ計算出的蛋白變化在1.3-1.6倍之間，可檢測低豐度蛋白；
- 分離能力強：可分離出酸/堿性蛋白，小于10KDa或大于200KDa的蛋白、難溶性蛋白等；
- 自動化程度高：液質(zhì)聯(lián)用，自動化操作，分析速度快，分離效果好。
6.技術(shù)參數(shù)
- 本要求：
動物及臨床組織標(biāo)本 100 mg/sample
血清、血漿 200μL/sample
細胞 、微生物 1×107 cells/sample
植物嫩葉、嫩芽 500mg/sample
植物種子 200mg/sample
植物果肉 20g/sample
- 儲存和運輸：
液氮或-80℃保存；足量干冰運輸，避免反復(fù)凍融。
- 檢測平臺：
7.應(yīng)用方向
- 臨床生物學(xué)及藥理學(xué)應(yīng)用方向
生物疾病標(biāo)志物研究；生物疾病發(fā)生發(fā)展過程分子機制研究；化學(xué)或生物藥物作用靶點研究；化學(xué)或生物藥物作用機理信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究。
- 農(nóng)林業(yè)等應(yīng)用方向
畜牧業(yè)領(lǐng)域：提高肉類品質(zhì)和飼養(yǎng)條件；農(nóng)業(yè)領(lǐng)域：農(nóng)作物發(fā)育機制的研究；食品科學(xué)領(lǐng)域：提高食品安全，改善口感和營養(yǎng)程度的研究；病毒領(lǐng)域：新型病毒抑制因子的挖掘研究。
8.案例分享
應(yīng)用TMT技術(shù)研究由于年齡和高脂飲食引起的小鼠附睪脂肪組織蛋白質(zhì)組的變化
Extended Multiplexing of Tandem Mass Tags (TMT) Labeling Reveals Age and High Fat Diet Specific Proteome Changes in Mouse Epididymal Adipose Tissue
研究內(nèi)容：小鼠附睪脂肪組織的TMT蛋白質(zhì)組學(xué)
發(fā)表期刊：Molecular & Cellular Proteomics
影響因子：IF=6.54
研究背景：
肥胖癥是一種世界性流行病，與代謝并發(fā)癥如2型糖尿病、高血壓、血脂異常和動脈粥樣硬化的發(fā)病率增加有關(guān)。過去由于缺乏有效的高通量技術(shù)手段限制了對附睪組織的整個白色脂肪組織蛋白質(zhì)組變化的研究。因而作者利用多組高通量TMT標(biāo)記定量蛋白組技術(shù)對小鼠附睪組織的蛋白質(zhì)組進行了深入的研究。
實驗樣本：
將20只8周齡的小鼠進行低脂或高脂飲食的喂養(yǎng)，時間為短(8周)或長(18周)(每個實驗組5只小鼠)。收集附睪脂肪，溶解，取100mg進行胰蛋白酶消化。用TMT-10plex標(biāo)記樣品和pool樣本，合并上機后分為9個餾分。報告離子強度使用內(nèi)部參考標(biāo)度(IRS)進行標(biāo)準(zhǔn)化。差異表達的蛋白質(zhì)通過edgeR的篩選來確定，并通過基因富集和網(wǎng)絡(luò)分析進行表征。
實驗策略：
采用了三組TMT-10-plex試劑盒進行標(biāo)記。
分析軟件：
Proteome Discoverer(1.4.1.14 version,Thermo Scientific), SEQUEST
分析策略：
Volcano plots ,Pearson correlation, Network analysis, Gene Enrichment
研究路線：
生信分析：
6.百趣協(xié)助客戶發(fā)表文獻
（可點擊標(biāo)題或圖片閱讀原文）
1. 通過調(diào)節(jié)微環(huán)境和代謝選擇性對抗缺氧腫瘤的高效Pt（IV）前藥研究
CAIXplatins: highly potent Pt(IV) prodrugs selectively against hypoxic tumors via microenvironment and metabolism regulation
發(fā)表期刊：Angewandte Chemie International Edition
發(fā)表時間：2020
影響因子：12.959
作者單位：中山大學(xué)
涉及的百趣服務(wù)產(chǎn)品：iTRAQ標(biāo)記定量蛋白組
樣本類型：人細胞
主要研究內(nèi)容：
缺氧和酸性微環(huán)境在腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成中起著至關(guān)重要的作用，通常會損害化療效果。作者開發(fā)了兩種靶向碳酸酐酶IX（CAIX）的鉑（IV）前藥CAIXplatins，采用iTRAQ蛋白組等實驗方法研究了其設(shè)計的合理性和功效，結(jié)果表明CAIXplatins對CAIX有著很強的親和力和抑制性，不僅可以克服腫瘤缺氧和酸性微環(huán)境的問題，也可以抑制缺氧癌細胞的代謝通路， 而且CAIXplatins的腫瘤選擇性是順鉑/奧沙利鉑的70~90倍，其全身副作用也得到了有效緩解，因此具有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景。
2. 慢性低氧誘導(dǎo)的Cirbp高甲基化會弱化低溫狀態(tài)下的心臟保護作用
Chronic hypoxia–induced Cirbp hypermethylation attenuates hypothermic cardioprotection via down-regulation of ubiquinone biosynthesis
發(fā)表期刊：Science Translational Medicine
發(fā)表時間：2019
影響因子：16.71
作者單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院
涉及的百趣服務(wù)產(chǎn)品：iTRAQ標(biāo)記定量蛋白組
樣本類型：大鼠心臟組織
主要研究內(nèi)容：
在體外循環(huán)（CPB）期間通常使用治療性低溫來保護心臟免于心臟手術(shù)中的心肌損傷。而患有慢性缺氧（CH）的患者在心臟手術(shù)后具有嚴(yán)重心肌損傷的高風(fēng)險，但其潛在機制尚不清楚。文章首先利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了Cirbp信號軸中的多個重要蛋白，并在此基礎(chǔ)上進行深入的分子生物學(xué)研究。結(jié)果表明CIRBP-COQ6/9-CoQ10軸受損是造成Cirbp-/-大鼠嚴(yán)重心肌損傷和術(shù)后心功能不全的原因，而CoQ10補充的心臟停搏液改善CH大鼠的心臟保護作用。這是一項非常具有臨床意義的研究，為CH患者提供了個性化心臟保護策略的潛在可能性。
3. 棕櫚烯酸在急性前葡萄膜炎中的作用研究
Analysis of the role of palmitoleic acid in acute anterior uveitis
發(fā)表期刊：International Immunopharmacology
發(fā)表時間：2020
影響因子：3.943
作者單位：重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院
涉及的百趣服務(wù)產(chǎn)品：GC-MS、TMT標(biāo)記定量蛋白組
樣本類型：人糞便、細胞
主要研究內(nèi)容：
作為最常見的葡萄膜炎實體，急性前葡萄膜炎（AAU）損害眼睛前段的正常功能和結(jié)構(gòu)，前期研究發(fā)現(xiàn)患者與健康人之間糞便中棕櫚烯酸（PA）濃度存在顯著差異，本文主要使用GC-MS和TMT定量蛋白組等方法在體內(nèi)體外實驗中探討PA在 AAU發(fā)病中的作用，結(jié)果表明AAU患者糞便中PA的表達明顯增加。PA在臨床和實驗葡萄膜炎的發(fā)病機制中都起著作用。其作用可能是通過改變樹突狀細胞和CD4+T細胞的功能和分化來介導(dǎo)的。PA在小鼠模型中對樹突細胞和CD4+T細胞有免疫調(diào)節(jié)作用，并減輕疾病的嚴(yán)重程度。
4. 大腸桿菌中產(chǎn)廣譜β-內(nèi)酰胺酶的潛在機制研究
Proteomics and metabolomics analysis reveal potential mechanism of extended-spectrum blactamase production in Escherichia coli
發(fā)表期刊：RSC Advances
發(fā)表時間：2020
影響因子：3.119
作者單位：吉林大學(xué)
涉及的百趣服務(wù)產(chǎn)品：TMT標(biāo)記定量蛋白組、LC-MS/MS非靶代謝組學(xué)
樣本類型：大腸桿菌
主要研究內(nèi)容：
在本研究中，應(yīng)用TMT蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合分析來比較β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感大腸桿菌和產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌（ESBL-EC）菌株之間蛋白質(zhì)和代謝物的差異，結(jié)果表明超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的存在影響大腸桿菌的代謝物和蛋白質(zhì)譜，差異蛋白和差異代謝物可能在ESBL-EC的抗生素耐藥性中起重要作用。該研究可以在代謝物和蛋白質(zhì)水平上為ESBL-EC抗生素耐藥性的機制研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)，針對這些途徑的調(diào)節(jié)劑可能對ESBL-EC菌株的治療有效并揭示臨床大腸桿菌菌株的抗生素抗性機制。
