naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)在精準定量HIV潛伏病毒的應(yīng)用

自從引入聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法 (ART) 以來，HIV-1感染已從一種致命疾病轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N可控制的慢性疾病。然而，雖然ART可有效抑制個體的病毒復(fù)制，但它并不能治愈HIV-1感染。這是由于患者體內(nèi)存在一個潛伏病毒庫（latent resservoir），其中包含一小部分具有復(fù)制能力的完整原病毒（約占1-5%），在ART停止后為病毒復(fù)制提供“燃料”。因此，科學(xué)家若想通過消除該病毒庫達到HIV-1治愈的目的，就不得不對這些完整原病毒進行準確評估。但是，接受ART治療的患者可能具有載量非常小的完整潛伏病毒庫，在有限的血液采樣中進行檢測，可能會遺漏這些潛在儲庫。

▲圖源：網(wǎng)絡(luò)（侵刪）

在過去的幾年里，已經(jīng)出現(xiàn)了幾種基于PCR與二代測序 (NGS) 相結(jié)合來檢測病毒庫的方法。比如基于雙重dPCR方法來量化HIV-1患者的完整原病毒，即IPDA（intact proviral DNA assay）方法，該方法通過雙重實驗檢測HIV-1基因組中的PSI和ENV兩個靶點。另一種常見方法是Q4PCR，其在HIV-1全長測序方案中引入了四重qPCR，在全長測序之前評估HIV-1基因組的完整性。盡管這些方法提高了檢測靈敏度并且可以提供全長的 HIV-1序列，但其成本效益不高，需要多步人工操作且耗時較長。

比利時根特大學(xué)、根特大學(xué)數(shù)字PCR聯(lián)盟、艾滋病毒治療研究中心等科學(xué)家近日在知名期刊《Methods》上發(fā)表了一篇HIV-1病毒庫研究相關(guān)文獻，文章對IPDA方法和Q4PCR方法進行集成，并在naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)進行驗證，該方法增加了IPDA 方法檢測HIV-1的靶點數(shù)量，提高了檢測靈敏度，實現(xiàn)對潛伏病毒庫的精準定量。

研究方法：

結(jié)合IPDA和Q4PCR方法，設(shè)計基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的三重數(shù)字PCR實驗。

☑ PSI靶點-FAM藍色探針標記

☑ ENV靶點-HEX綠色探針標記

☑ GAG靶點 & POL靶點-Cy5紅色探針標記

▲ 靶點對應(yīng)的基因組位置圖

研究結(jié)果：

☑ 使用J-Lat 8.4細胞系（每個細胞含有1拷貝的HIV-1基因組）進行單重實驗，并測定naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)三重試驗的性能，結(jié)果顯示定量結(jié)果和理論值一致，重復(fù)性好；各靶標陰陽性微滴區(qū)分良好。

▲ 對陽性對照J-Lat 8.4細胞的拷貝數(shù)進行量化-設(shè)定PSI、ENV、GAG/POL單重檢測

及IPDA和三重等多重實驗，并對DNA剪切情況進行校正（DSI）

☑ 使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)直接定量來自HIV-1患者的五個PBMC樣本，這些樣本病毒載量較低，且均經(jīng)過ART治療，檢測結(jié)果顯示5個患者均檢出了HIV-1。此外，發(fā)現(xiàn)一個比較有趣的現(xiàn)象，在患者SLR_26樣本中幾乎沒有檢測到ENV且PSI也只有非常低的信號，該結(jié)果表明PSI和ENV序列中可能存在缺失或突變，如果只檢測這兩個靶點的話，該病人可能被判讀為HIV-1陰性。幸運的是，使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)設(shè)計的三重實驗，GAG或POL基因正常檢出，表明該樣本含有HIV-1。
 

▲ 使用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對5個HIV-1病人的PBMC(每百萬個)進行定量

文章結(jié)論：

通過naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對HIV-1患者潛伏病毒庫進行了量化，相較于傳統(tǒng)方法增加了亞基因組區(qū)域的檢測數(shù)量，提高了對潛伏病毒庫的檢測的靈敏度，降低結(jié)果誤判的可能性，且該方法甚至可以在未來開發(fā)的5色或6色的數(shù)字PCR系統(tǒng)中進一步放大。

原文鏈接如下：https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2021.05.006

單位簡介：

根特大學(xué)（Ghent University），簡稱UGent，由荷蘭國王威廉一世于1817年創(chuàng)辦，迄今已有200多年歷史，是比利時學(xué)術(shù)排名第一的世界頂尖研究型大學(xué)，一直以其極高的學(xué)術(shù)水平享譽全球，2020年世界大學(xué)學(xué)術(shù)排名中位列第66名，根特大學(xué)校友中誕生了4位諾貝爾獎得主。

隨著數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展，根特大學(xué)已成立數(shù)字PCR聯(lián)盟，該聯(lián)盟致力于開發(fā)數(shù)字PCR檢測和數(shù)據(jù)分析工具，同時該平臺還會不定期舉辦數(shù)字PCR培訓(xùn)課程，幫助廣大學(xué)子及專業(yè)人士更好的了解和應(yīng)用數(shù)字PCR技術(shù)。

naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司的naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)在進行核酸檢測時具有獨特的優(yōu)勢。該系統(tǒng)利用cutting-edge微流體創(chuàng)新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作為數(shù)字PCR過程的耗材。樣品通過毛細通道網(wǎng)格以30,000個微滴的形式進入2D芯片中。3色熒光檢測儀器，整個流程只需要2.5小時，并可進行數(shù)據(jù)的質(zhì)控和結(jié)果追溯分析，獲得的數(shù)據(jù)真實可靠。