反相快速制備閃式色譜聚焦梯度優(yōu)化方法
摘 要
在ACCQPrep® HP150 系統(tǒng)使用自動聚焦梯度發(fā)生器，人們無需再花時間開發(fā)或優(yōu)化閃式色譜聚焦梯度方法。從單次運行分析偵察的結(jié)果，由內(nèi)置工具自動計算生成聚焦梯度， 以確定是否能夠在CombiFlash® NextGen 系統(tǒng)上有效運行特定的純化，以及制備型 HPLC 的聚焦梯度的計算或閃式色譜的純化。當使用 RediSep®制備型HPLC色譜柱與 RediSep Gold®相匹配的色譜柱，以確定樣品純化和計算閃式色譜聚焦梯度，在運行時間為7 - 12min內(nèi)完成（取決于HPLC系統(tǒng)和所使用的色譜柱）。也可以使用分析型 HPLC 系統(tǒng)通過ACCQPrep 聚焦梯度生成器以計算快速色譜梯度（參見Teledyne ISCO 網(wǎng)站上的技術報告TN52）。
背景
反相快速色譜技術由于缺乏方法的快速開發(fā)技巧而受到阻礙，正相快速色譜方法的開發(fā)可以用薄層色譜 (TLC) 板完成，但如果樣品洗脫在超過 60% 的含水溶劑系統(tǒng)，反相薄層板需要很長時間才能完成。另一種手段是直接在閃式色譜系統(tǒng)上開發(fā)方法，但這會消耗大量溶劑和樣品；或者可以在分析 HPLC 系統(tǒng)開發(fā)方法，然后轉(zhuǎn)移到閃式色譜系統(tǒng)，通常涉及多次嘗試并且需要相匹配的分析柱和閃式快速色譜柱（如應用報告AN118 中所述）。使用配備RediSep Prep 色譜柱的ACCQPrep制備色譜上的梯度生成器工具，將避免了所有這些問題，不僅節(jié)省時間、樣品和溶劑，而且對容易純化的樣品還可以使用快速制備系統(tǒng)進行，這將避免大量的分離純化在高壓制備完成而導致ACCQPrep 系統(tǒng)的工作量壓力。實驗和結(jié)果
使用以下流程開發(fā)閃式色譜的聚焦偵察運行梯度。1、在 ACCQPrep 上運行聚焦梯度生成器，使用待純化樣本進行純化。使用內(nèi)置聚焦梯度生成器，或者分析HPLC的聚焦梯度計算工具，如果使用 ACCQPrep 進行偵察運行，則使用流程“a”。流程“b”用于使用 ACCQPrep 校準的 HPLC 系統(tǒng)。
a、使用 20x150 mm Redisep 制備色譜柱計算需純化的化合物的聚焦梯度。請注意，Redisep 制備色譜柱應與 RediSep 反相色譜柱化學性能相匹配，從而避免色譜柱選擇性的差異。記錄開始和結(jié)束聚焦梯度的點；這些值將用于快速閃式色譜系統(tǒng)。
b、確保 ACCQPrep 和分析HPLC已根據(jù)技術說明 TN52 進行校準。
使用 2 x 50 mm 或 4.6x150 mm RedisSep Prep與閃式色譜柱化學性能相匹配的分析色譜柱，例如 RediSep Gold C8，C18 或 C18AQ。輸入ACCQPrep 中的目標峰保留時間來計算聚焦梯度。記錄開始和結(jié)束聚焦梯度的點；這些值將用于快速色譜系統(tǒng)。
2、判斷要純化的化合物與最接近的雜質(zhì)之間是否有足夠的分離度，確定這一點的最簡單方法是計算雜質(zhì)和目標的化合物的聚焦梯度，然后注意每種方法的聚焦梯度起點，如果雜質(zhì)梯度起始點的溶劑組成與目標化合物相距超過 3% 的B，純化可以是在閃式色譜柱上運行；否則將需要 ACCQPrep系統(tǒng)。起點梯度溶劑組成值的差別，不因ACCQPrep 使用內(nèi)部計算或使用外部 HPLC計算工具將是相同的。另一種評估所需的分離度方法取決于偵察梯度中的峰值保留時間的差異。確定偵察梯度斜率 m = (Ending %B – Start%B)/梯度時間。對于圖 1 中的示例是 (100-5)/6 = 15.8。因為我們要解析的峰，在快速色譜柱需要達到3%的分離度，將 3 除以斜率，公式為：Δ%B = 3/m。圖 1 中為了達到 6 分鐘梯度，3/15.8 = 0.19，舍入到≈0.2 分鐘。這意味著峰值解析度在偵察梯度至少0.2分鐘，可用于CombiFlash NextGen 系統(tǒng)純化。
3、在CombiFlash NextGen 上加載和偵察運行使用類型相同的色譜柱，使用方法編輯器的創(chuàng)建以柱體積為單位的聚焦梯度，選擇和偵察運行相同的溶劑，包括修飾劑，%B 的開頭和結(jié)尾與聚焦梯度和ACCQPrep 梯度長度，以柱體積為單位，如表 1 所列，當固體上樣方式使用時，需要延長梯度時間。
下面的例子使用了辣椒素的混合物，選擇達到快速色譜的分離度極限。
第一步是執(zhí)行偵察運行，確定第一個洗脫峰的梯度在~7.5min時。使用RediSep 制備 20 x150 mm色譜柱 (PN 69-2203-810)用于偵察篩選運行，水/甲醇梯度。
結(jié)論
僅使用來自用于評估樣品純度的篩選運行的數(shù)據(jù)，和使用ACCQPrep 內(nèi)置的聚焦梯度生成器允許在 12min內(nèi)確定優(yōu)化閃式色譜的方法，該工具還允許用戶提前確定在快速色譜柱上運行目標化合物和最近的雜質(zhì)之間是否有足夠的分離度，或者如果需要更高的分離度，ACCQPrep 是否為必需的；在給定的分離度下，ACCQPrep 計算的梯度可以用于閃式快速純化；或繼續(xù)運行ACCQPrep。
ACCQ Prep HP150 高壓制備型HPLC色譜系統(tǒng)
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流速1-150 mL/min開發(fā)分析方法和制備方法
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操作壓力可達6000 psi
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UV或UV/VIS基礎上選擇ELSD和MS檢測器
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一鍵生成聚焦優(yōu)化梯度
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純化時間最小化，樣本回收率最大化
快速中低壓制備色譜儀系列
CombiFlash® NextGEN系列快色液相制備色譜儀可從制備純化過程中進行自動識別色譜尺寸和類型，提高制備實驗效率，無論是在提純合成化合物、天然產(chǎn)品、肽或聚合物。直觀的PeakTrak軟件可在數(shù)秒內(nèi)開始分離。根據(jù)要純化的樣品的類型和數(shù)量選擇正相或反相柱，允許RFID標簽載入運行參數(shù)，確認檢測器設置(UV, Vis, ELS和MS)，按下開始，載入樣品，即可開始自動工作，無需人員值守。實驗進行時隨時更改參數(shù)？當分離實驗開始時，依然可以修改參數(shù)，包括溶劑百分比、波長、流速和運行時間等，不需要進行重復分離。
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流量300ml和壓力300psi
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允許運行750 g或高達1-2kg的色譜柱
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以較高的壓力極限純化低溶解度的樣品
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12"或15"智能觸摸屏
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更寬動態(tài)范圍的檢測器
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改進的基線校正支持使用吸收性溶劑
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通過簡化的用戶界面更快地處理
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節(jié)省空間：頂部托盤可容納四個4L的瓶子
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改進的梯度曲線可減少多達50%的溶劑
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