基因編輯技術(shù)在小分子藥物研發(fā)中的應(yīng)用

小分子藥物研發(fā)現(xiàn)狀
藥物研發(fā)是一個(gè)跨學(xué)科整合板塊，隨著各學(xué)科基礎(chǔ)研究和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)安全有效藥物的需求也日益增加。從2015年-2020年，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了245款新藥物，其中小分子藥物有164種，占到62%。批準(zhǔn)小分子藥物涵蓋了抗腫瘤、抗感染、神經(jīng)系統(tǒng)、自身免疫、代謝等范疇，是藥物研發(fā)重點(diǎn)方向[1]（1. U.S. FDA Approved Drugs from 2015-June 2020: A Perspective）。一個(gè)小分子藥物的發(fā)現(xiàn)需要化學(xué)、生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)學(xué)科的精耕細(xì)作，從候選分子篩選到臨床上市，大約需要10年時(shí)間。藥物研發(fā)宗旨是安全有效，具有高投入、低產(chǎn)出特征，每年僅有屈指可數(shù)的藥物分子通過審批，從Phase I階段到批準(zhǔn)上市成功率約為9.5%，尤其是抗腫瘤小分子靶向藥物成功率僅為5.1%，排名最靠后[2]，如圖1（Clinical Development Success Rates 2006-2015）。小分子藥物成功率低主要受限于以下因素：

（1）缺乏新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)；
（2）缺乏合理和針對(duì)性的臨床前評(píng)價(jià)體系和模型；
（3）易出現(xiàn)耐藥性。
 

圖1. 各類疾病藥物研發(fā)的成功率

近年來，小分子藥物發(fā)展更是受到了抗體藥物、基因療法、細(xì)胞療法、ADC藥物、溶瘤病毒的強(qiáng)勢(shì)競(jìng)爭(zhēng)，因此急需解決以上技術(shù)難題，提高小分子藥物研發(fā)效率、成功率與競(jìng)爭(zhēng)力。

基因編輯技術(shù)簡(jiǎn)介與原理
基因編輯技術(shù)為經(jīng)典和常用的分子生物學(xué)技術(shù)，在藥物研發(fā)、基因治療、基礎(chǔ)研究、診斷技術(shù)開發(fā)等方面廣泛應(yīng)用。對(duì)于小分子藥物研發(fā)，基因編輯可以通過基因敲入、基因敲除、堿基轉(zhuǎn)換、染色重排，順利解決上述臨床前評(píng)價(jià)體系、新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、耐藥性問題。

基因編輯技術(shù)的核心是通過程序化的人工核酸酶，定點(diǎn)對(duì)基因組DNA進(jìn)行改造。到目前為止，總共有3款基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用，第一代鋅指核酸酶 (zinc-finger nuclease, ZFN)技術(shù)、第二代轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技術(shù)、第三代CRISPR/Cas9 技術(shù)，在藥物研發(fā)、基因療法、細(xì)胞療法方面應(yīng)用廣泛[3]（基因編輯技術(shù)的原理及其在癌癥研究中的應(yīng)用），如圖2所示。
 

 

圖2. ZEN，TALEN，CRISPR基因編輯原理

三代基因編輯技術(shù)各有優(yōu)劣勢(shì)，ZFN技術(shù)易脫靶、效率低、時(shí)間周期長(zhǎng)；TALEN技術(shù)通量小、難以做到多基因敲除，都極大的限制了技術(shù)的應(yīng)用，而第三代技術(shù)兼?zhèn)渫�量、技術(shù)壁壘降低、成本時(shí)間耗用少優(yōu)勢(shì)，得到大規(guī)模應(yīng)用和推廣，更是獲得了2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，本文將以第三代CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)為例，詳細(xì)介紹其在小分子藥物研發(fā)中的應(yīng)用，如表1所示。
 

表1. 三種基因編輯技術(shù)優(yōu)劣勢(shì)比較

 

基因編輯技術(shù)在小分子藥物研發(fā)中應(yīng)用
CRISPR/Cas9本身為原核生物免疫系統(tǒng)抵御外來病原體的一部分，將其引入基因編輯領(lǐng)域，可以高效準(zhǔn)確的進(jìn)行目的基因缺失、插入、堿基替換等工作，豐富了生物科學(xué)家的技術(shù)手段。以小分子靶向藥物治療為主的肺癌、乳腺癌、血液瘤為例，該類疾病基因分型完善，標(biāo)準(zhǔn)臨床治療方案為結(jié)合分子病理分型選取相應(yīng)小分子藥物加以治療，如EGFR T790M突變采用三代EGFR抑制劑奧西替尼，BRCA1/2同源重組修復(fù)缺陷變化采用PARP抑制劑，BCR-ABL融合使用伊馬替尼。

構(gòu)建點(diǎn)突變模型
基因編輯技術(shù)可以為這類型的小分子藥物研發(fā)提供臨床前篩選平臺(tái)。藥物研發(fā)，前期都需在特異性體內(nèi)外模型中進(jìn)行候選分子篩選和驗(yàn)證。傳統(tǒng)方法構(gòu)建篩選驗(yàn)證平臺(tái)難以模擬發(fā)病機(jī)制，建模耗時(shí)長(zhǎng)、成功率低，而基因編輯技術(shù)可以從基因組水平編輯目的基因，可高度模擬疾病機(jī)制和進(jìn)展?fàn)顟B(tài)，極大簡(jiǎn)化了建模流程、縮短建模周期。目前常用的EGFR常見突變、罕見突變、外顯子插入細(xì)胞模型，都是根據(jù)基因編輯技術(shù)在細(xì)胞層面進(jìn)行改造，如EGFR T790M、C797S、L858R、G719X、L861Q、S768I、20號(hào)外顯子插入（exon20ins）等。Mi-Young Park等人[4]（Generation of lung cancer cell lines harboring EGFR T790M mutation by CRISPR/Cas9-mediated genome editing）通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了PC9 T790M突變?cè)鰪?qiáng)型細(xì)胞株，在PC9原有基礎(chǔ)上提高了T790M突變比例，并且在等量吉非替尼暴露下，PC9 T790M突變細(xì)胞株耐藥性更強(qiáng)，但對(duì)奧西替尼敏感性更強(qiáng)。因此利用CRISPR/Cas9構(gòu)建的點(diǎn)突變細(xì)胞株效率更高，更適用于三代EGFR小分子抑制劑篩選。

構(gòu)建基因融合模型
此外，基因編輯技術(shù)可進(jìn)行染色體重排，為血液瘤提供疾病模型。許多血液瘤發(fā)病起源于染色體上基因重排或融合，如CML/AML（慢性粒細(xì)胞白血病/急性粒細(xì)胞白血�。┡cBCR-ABL基因融合相關(guān)，PDGRFα重排與CEL（慢性嗜酸性粒細(xì)胞白血�。┫嚓P(guān)，并且由于血液瘤發(fā)病進(jìn)程長(zhǎng)，疾病分子變化復(fù)雜，構(gòu)建難度和疾病模擬度都需要更加成熟的技術(shù)手段。Icahn Mount Sinai大學(xué)的研究者們[5]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，以多能干細(xì)胞（iPS）為載體，將AML疾病相關(guān)基因ASXL1/SRSF2/NRAS按照順序編輯導(dǎo)入多能干細(xì)胞中，創(chuàng)建一個(gè)突變不斷增加的腫瘤疾病細(xì)胞模型，可模擬AML發(fā)病全程，從早期異常血象開始，到骨髓異常增生，到后期演變?yōu)锳ML，便于觀察各階段轉(zhuǎn)換機(jī)制。由此可見，基因編輯技術(shù)可為小分子藥物研發(fā)提供更貼合實(shí)際的細(xì)胞與動(dòng)物模型。該類型例子更是在代謝疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)有廣泛應(yīng)用。
 

圖3. 模擬AML疾病進(jìn)程轉(zhuǎn)換
 

圖4. AML與CRISPR/Cas9實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

 

發(fā)現(xiàn)新藥物靶點(diǎn)
CRISPR/Cas9技術(shù)可大規(guī)模篩選藥物靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)新藥物靶點(diǎn)。目前人類基因組編碼的蛋白質(zhì)中，約75%的靶點(diǎn)被認(rèn)為與疾病治療無關(guān)，而剩余25%的靶點(diǎn)中又有60%的靶點(diǎn)無法成藥。目前已知的約5000個(gè)疾病分子基礎(chǔ)中，只有250中疾病有治療方案，因此發(fā)現(xiàn)藥物新作用靶點(diǎn)對(duì)藥物研發(fā)至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)人員[6]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)靶向編碼蛋白功能性區(qū)域的外顯子序列，對(duì)小鼠急性髓系白血病細(xì)胞系中192個(gè)染色質(zhì)功能調(diào)節(jié)區(qū)域進(jìn)行了篩選，證實(shí)了6個(gè)已在研的藥物靶點(diǎn)，19個(gè)潛在藥物作用新靶點(diǎn)，DOT1L, EZH2, EHMT1/2、KDM1A做為MLL-AF9白血病藥物靶點(diǎn)開發(fā)了相關(guān)抑制劑（Discovery of cancer drug targets by CRISPR/Cas9 screening of protein domains）。由此可見，利用基因編輯技術(shù)可發(fā)現(xiàn)全新藥物作用靶點(diǎn)，豐富小分子藥物產(chǎn)品管線。
 

圖5. CRISPR/Cas9靶向編碼蛋白外顯子序列原理

 

圖6. 差異基因篩選

 

協(xié)同致死研究
CRISPR/Cas9技術(shù)可作為協(xié)同致死研究手段，大規(guī)模驗(yàn)證基因互做關(guān)系，為小分子藥物找到效應(yīng)組合，達(dá)到擴(kuò)增適應(yīng)癥、增加臨床獲益目的。John Paul Shen等人[7]利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯HeLa，A549和293T細(xì)胞系，通過測(cè)試兩個(gè)靶向基因?qū)��?xì)胞生長(zhǎng)的影響判斷兩者間作用關(guān)系。研究者們共分析了73個(gè)基因，進(jìn)行了141,912次交互作用分析，最后發(fā)現(xiàn)這73個(gè)癌基因之間的遺傳關(guān)系，存在著152對(duì)協(xié)同致死效應(yīng)組合。包括BRCA1/2同源重組修復(fù)缺陷指導(dǎo)PARP抑制劑用藥，CCND1與CDK4/6抑制劑，PTEN與mTOR抑制劑。
 

圖7. CRISPR/Cas9篩選協(xié)同致死組合

基因編輯技術(shù)在小分子藥物研發(fā)中應(yīng)用廣泛，涵蓋小分子藥物研發(fā)全流程。從候選分子篩選、藥理學(xué)研究、毒理研究到轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)都可借助基因編輯。隨著技術(shù)發(fā)展，更是滲透到臨床診療。張力教授團(tuán)隊(duì)在肺癌中發(fā)現(xiàn)新ALK融合位點(diǎn)，使用基因編輯技術(shù)驗(yàn)證了新融合組合功能和對(duì)ALK抑制劑敏感性，最后輔助患者臨床用藥，并獲得較好臨床藥效。因此，伴隨醫(yī)學(xué)與生物學(xué)的完善，基因編輯技術(shù)在小分子藥物研發(fā)中應(yīng)用將在基因敲入、敲除、堿基轉(zhuǎn)換基礎(chǔ)上向外拓展，獲得更多樣化發(fā)展。

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助力小分子藥物研發(fā)

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參考文獻(xiàn)：

[1] Bhutani, P., et al., U.S. FDA Approved Drugs from 2015–June 2020: A Perspective. Journal of Medicinal Chemistry, 2021. 64(5).

[2] Mullard, A., Parsing clinical success rates. Nature Reviews Drug Discovery, 2016. 15(7): p. 447.

[3] 謝一方, et al., 基因編輯技術(shù)的原理及其在癌癥研究中的應(yīng)用. 中國(guó)腫瘤生物治療雜志, 2017. 08(v.24;No.119): p. 6-18.

[4] Park, M.Y., et al., Generation of lung cancer cell lines harboring EGFR T790M mutation by CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Oncotarget, 2017. 8(22).

[5] Wang, T., et al., Sequential CRISPR gene editing in human iPSCs charts the clonal evolution of leukemia. 2020.

[6] Junwei, et al., Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.