多光譜顯微表型成像平臺Videometer在植物病理學(xué)上的應(yīng)用實(shí)例分享

VideometerMic多光譜顯微表型成像系統(tǒng)是一套突破性的多光譜成像系統(tǒng)。采用了少有的光譜成像檢測技術(shù)。在提高信噪比和多靶點(diǎn)標(biāo)記的檢測方面，完全克服了傳統(tǒng)成像技術(shù)的限制。可應(yīng)用于植物、細(xì)胞、基因或蛋白芯片等研究領(lǐng)域，是一套功能強(qiáng)大的成像系統(tǒng)。該基礎(chǔ)模塊包括10個-20個散射波段，波長范圍為280-1050nm，攝像頭可固定或移動，集成的多光譜傳感器安裝在XYZ平臺上，實(shí)現(xiàn)30cmX30cm的樣品自聚焦和掃描，可測量較小的樣品，可用于擬南芥種子、細(xì)菌、真菌、蟲卵、細(xì)胞等成像。 

VideometerMic多光譜顯微表型成像系統(tǒng)將傳統(tǒng)多光譜成像系統(tǒng)升級為多光譜成像系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有強(qiáng)大熒光標(biāo)記的檢測、分離和分析功能。在明場或暗場的應(yīng)用方面同樣具有其它系統(tǒng)所無法比擬的功能，在分析過程中，通過系統(tǒng)設(shè)置的激發(fā)光源組和內(nèi)置在10-20位濾波輪中的一系列濾波器激發(fā)植物樣品中各種發(fā)色團(tuán)的動態(tài)熒光。樣品激發(fā)出的熒光經(jīng)顯微鏡放大后進(jìn)行熒光光譜分析和成像分。

VideometerMic多光譜顯微表型成像系統(tǒng)是目前功能強(qiáng)大、全面的多光譜顯微表型成像系統(tǒng)，可以進(jìn)行微藻、單個細(xì)胞、單個葉綠體甚至基粒-基質(zhì)類囊體片段進(jìn)行圖像熒光分析；還能通過激發(fā)光源組進(jìn)行進(jìn)行任意熒光激發(fā)和熒光釋放波段的測量，從而進(jìn)行GFP、DAPI等熒光蛋白、熒光素以及藻青蛋白、藻紅蛋白、藻膽素等藻類特有熒光色素的成像分析；較可以利用光譜儀對各種熒光進(jìn)行光譜分析，區(qū)分各發(fā)色團(tuán)。

VideometerMic多光譜顯微表型成像系統(tǒng)應(yīng)用

熒光及明場多色標(biāo)記應(yīng)用領(lǐng)域；量子點(diǎn)探針的應(yīng)用領(lǐng)域；分子病理學(xué)研究領(lǐng)域；植物學(xué)研究領(lǐng)域；植物病理學(xué)領(lǐng)域；表型性狀分析/挖掘，基因型-表型關(guān)聯(lián)；農(nóng)業(yè)育種；園藝學(xué)、農(nóng)業(yè)信息學(xué)；果實(shí)品質(zhì)分析；植物病理研究；生物量分析；種子萌發(fā)研究；抗逆研究；植物應(yīng)用領(lǐng)域；顯微結(jié)構(gòu)的植物生理研究；植物逆境研究；生物和非生物脅迫的研究；植物抗脅迫能力及易感性研究；突變體篩選及光合機(jī)理研究；藻類長勢與產(chǎn)量評估；藻類特有色素；植物—微生物交互作用研究；植物—原生動物交互作用研究；基因工程與分子生物學(xué)研究 ；測量植物樣品；花粉分析；植物活體切片；植物表皮；植物細(xì)胞；綠藻、藍(lán)藻等各種單細(xì)胞和多細(xì)胞微藻；葉綠體提取液；類囊體提取液；含有葉綠體的原生動物。

小麥?zhǔn)侨�世界最重要的作物之一，對全球食品安全至關(guān)重要�！癟ake-all ”根病害是由子囊菌真菌Gaeumannomyces tritici(Gt)致病，可穿透根并毀壞維管系統(tǒng)。形成的黑色壞死斑破壞了養(yǎng)分和水吸收，導(dǎo)致減產(chǎn)達(dá)60%。其它密切相關(guān)子囊菌真菌品種，例如G. hyphopodioides(Gh),卻是對抗“take-all”病的生物控制劑。

G.hyphopodioides可侵染外皮質(zhì)根層，但與“Take-all”不同，其不會侵入到中間部位，特征是在菌表面和亞皮下囊泡形成灰色菌絲。

來自英國的科學(xué)家研究重點(diǎn)是對高級成像技術(shù)進(jìn)行評估，以對根定植進(jìn)行真菌檢測和精確定量，通過測量光合參數(shù)評估對地上部健康的影響。研究中使用了VideometerLab 多光譜成像系統(tǒng)。

圖中顯示“Take-all”感染小麥幼苗。左側(cè)是原始圖像，有紅色箭頭標(biāo)示“take-all ”損失，用手工評分；右圖是相同圖像經(jīng)‘VideometerLab’分析，將根組織分類為感病(藍(lán)色)和健康(桔色/黃色)。

具體實(shí)驗(yàn)步驟：

A 5-week time-course seedling pot bioassay was set up using 250g of soil from Webb’s Field on the Rothamsted Farm, UK.

An artificial inoculum layer derived from PDA plates contained Gt, Gh or an uncolonised control. The pots were baited with 10 seeds of the wheat cultivar‘Hereward’, and kept in a controlled environment room. Each week, the pots were visually assessed for the presence of necrotic lesions, greying and vesicles. The level of infection was recorded as the proportion of roots showing at least one area of fungal colonisation, making this a semi-quantitative method of assessment. Potentially, imaging could provide a more efficient method to assess root colonisation, allowing the affected root area to be accurately quantified and also removing the subjectivity that can be associated with manual scoring. Consequently, a key question was: can multispectral imaging be used to quantitatively assess and distinguish between Gt and Gh seedling root colonisation?

Multispectral imaging was accomplished using a ‘VideometerLab’ imager, a system that uses 19 different wavelengths ranging from UV to the NIR. Training images were taken of healthy roots, and those colonised with Gt or Gh. These training images were used to build statistical transformations, which were subsequently used to score pixels as corresponding to healthy or colonised root tissue. The threshold pixel score chosen ensured that, in the case of Take-all, only the dark black lesions were scored. The ‘VideometerLab’ and visual assessments of Take-all colonised roots showed a significant correlation (Spearman’s Rank, Rs = 0.670, p = <0.001, n =24). Interestingly, whilst low, the Take-all scores for the uninoculated, control plants, were consistently higher using the image-based scoring. It is possible that the ‘VideometerLab’ was detecting other fungal colonisation phenotypes caused by contamination in the soil which were not visible to the human eye. The ‘VideometerLab’ struggled to distinguish the root greying caused by Gh from mild Take-all symptoms and preliminary analysis has shown that the root greying phenotypes associated with the presence of both fungal species have similar pixel scores across all wavelengths. However, the dark necrotic Take-all lesions had a distinct spectral signature, supporting the validity of our method for scoring Take-all.

Prior to harvesting the roots for the imaging described above, a LemnaTec ‘PhenoCenter’ was used to evaluate the impact of fungal root colonisation on above ground plant health. Specifically, a PAM fluorescence camera was used to evaluate photosynthetic efficiency in the foliage. This technique is based on the observation that light energy absorbed by photosystem II can be dissipated via three routes: photochemical reactions, dissipated heat or as fluorescence – it’s the competition between these processes which is exploited to quantify photosynthetic parameters. While a small reduction in photosynthetic efficiency was observed for the Take-all infected plants, no significant difference was observed between the Gh and control pots. These are encouraging results as it would be undesirable for Gh to impact photosynthetic efficiency if used as a biocontrol agent.

藜麥(Chenopodium quinoa)是一種作物，營養(yǎng)豐富，在多個國家廣有種植。真菌病如霜霉病限制了谷物產(chǎn)量，培育抗性品系，如抗霜霉病品系是藜麥育種的中心目標(biāo)。

利用常規(guī)RGB成像來測量藜麥對霜霉病的表型反應(yīng)(Peronospora variabilis ) 測量比較困難，原因在于來自不同藜麥基因型在葉片上有不同綠色和紅色斑點(diǎn)進(jìn)行干擾，參見圖1和圖2。 

開發(fā)圖像分析規(guī)程來區(qū)分健康藜麥葉片組織以及感染霜霉病的藜麥葉片組織。研究利用Videometer多光譜成像系統(tǒng)對嚴(yán)重度程度表型和孢子形成進(jìn)行研究。

嚴(yán)重程度是葉片正面損傷的面積占整個葉片面積的百分比。依基因型不同，顏色可為桔色、黃色或紅色。

孢子形成是損傷部上方孢子量，以百分比測量，通過測量葉片正面進(jìn)行評估。 

 圖1 葉片正面嚴(yán)重度癥狀

圖2 葉片正面孢子形成

多光譜圖像分析

研究人員利用VideometerLab 4多光譜成像系統(tǒng)進(jìn)行多光譜成像，積分球確保對樣品的均一照明(圖3)。每個獲取的圖像層由19個不同圖像波段組成，波長涵蓋365nm（UVA）到970nm（NIR）。圖像的每個像素分辨率為~41 µm。每個圖像層的分辨率為2192X2192像素。

圖像分析嚴(yán)重度模型

從G9基因型葉片正面(圖4)清楚看到了黃化現(xiàn)象(A)，拍攝了RGB圖像（常規(guī)相機(jī)，人眼可見光波段。(B)和(C)顯示了多光譜圖層中的2個波段，藍(lán)光490nm(B)和黃光570nm(C)。對健康植物組織和黃化界定進(jìn)行了初始標(biāo)記，首次轉(zhuǎn)換建立了模型(D)，通過nCDA（歸一化典型判別分析將19個波段信息（圖像中多個圖層），轉(zhuǎn)換為了整個圖層的代表像素范圍值。之后切割(E和F)，可用于所有圖像-所有品系和基因型，獲取有黃化組織（E黃色）百分比定量分析，該特定葉片比例為68.0%，或者包括紅色覆蓋孢子區(qū)(F)，比例為18,9%，黃化（黃色）比例68%，孢子和黃化區(qū)綜合面積占比75.8%。 

圖像分析孢子形成

在葉片正面（底部），RGB圖像中的G9基因型清晰可見到孢子形成圖像（下底部A和B放大）。盡管在可見光波段很難檢測到單個波段，這里特別標(biāo)出了藍(lán)光波段（490nm）（C）。進(jìn)入NIR（780nm）波段（下左部的D和E放大），清晰看見了孢子。使用該信息（僅標(biāo)識黑灰色孢子）可幫助我們區(qū)分切割孢子像素（F），并將該面積定量，該葉片孢子比例為12.5% （黃色顯示），不包括黃化部分面積。

另外，此處的孢子標(biāo)識與正面圖像分析而言更加保守。 覆蓋的非黑灰區(qū)的像素部分 (像素比單個孢子要大）估計，孢子比例為~23%（此處未予以顯示)。

圖4(A) sRGB圖像。(B)，490nm(藍(lán)光)，(C)，570nm(黃色)，(D) 轉(zhuǎn)換，(E)和(F)，2種類型定量分割。

圖5(A) sRGB 圖像，(B)490nm(藍(lán)光)，(C) 570nm(黃色)，(D)轉(zhuǎn)換，(E)定量分割。

結(jié)果

圖6:133個基因型的平均嚴(yán)重程度（%）分布

表1手工以及基于多光譜表型成像的藜麥霜霉病互作

研究對相關(guān)的132個藜麥基因型對霜霉病的表型反應(yīng)進(jìn)行了研究。設(shè)置了3個實(shí)驗(yàn)，每個有4個區(qū)塊，配有復(fù)制控制樣品以及非復(fù)制基因型樣品。找到了對P. variablilis 反應(yīng)變異大的藜麥基因型，發(fā)現(xiàn)了基因型對互作有著顯著影響 (p-value = 1.18 x 10-18) 圖6。研究人員對圖像表型研究結(jié)果進(jìn)行了比較，研究人員正在開發(fā)適合覆蓋整個反應(yīng)的算法。該綜述中，研究者展示了與G9基因型相對應(yīng)的葉片圖像。結(jié)果總結(jié)在表1中，來不同區(qū)塊和試驗(yàn)的分屬不同植株的10片葉子取了平均值。

多光譜成像如嚴(yán)格按照規(guī)程使用、記錄完善的話，是非常強(qiáng)勁的表型工具。對圖像定量基于算法應(yīng)用，這需融合對疾病反應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)和知識。對孢子形成，菌絲萌發(fā)，滲透，侵染面積以及健康組織識別可提供更加近似的像素標(biāo)識。

目前研究人員已經(jīng)開發(fā)出了可應(yīng)用于藜麥霜霉病互作的應(yīng)用于損傷組織算法。 

科學(xué)家開發(fā)了一種多光譜成像算法來評估小麥對鐮刀菌(F. graminearum and F. culmorum)的抗性。獲取結(jié)果與VDA方法視覺疾病評估）和qPCR方法進(jìn)行了比較。研究目標(biāo)是選擇新型、快速的表型方法來替換現(xiàn)有評價的VDA抗性評估方法。

視覺疾病評估方法與Videometer在不同生理階段對麥穗和群體的相關(guān)性(360-1050nm)

比RGB成像區(qū)分效果要好

傳送帶上獲取圖像

VideometerLab® 以及傳送帶

2056x2056 像素/波段

1000粒種子掃描僅需5-10 min

鐮刀菌感染區(qū)域鑒別

基于典型判別分析（CDA）分析感染麥粒(黃/紅），未感染 (藍(lán)色) 

鐮刀菌損害麥粒定量(FDK)

-分類像素的閾值化

-Excel 結(jié)果輸出

材料和方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)計:

- 噴灑接種：F.graminearum & F.  culmorum

- 冬小麥： 5栽培種  (抗性控制)

- 25 麥穗（2個重復(fù)）(使用 VDA和 Videometer)

田間視覺評分：  

360°C dpi : % 結(jié)痂小穗 ; % FDK

成熟 : % FDK

Videometer : % FDK

培養(yǎng)皿

-單穗：第1次重復(fù)25穗/cv

-散裝：≈從第2個重復(fù)的25個穗中收集1000粒/cv

傳送帶

‒散裝≈從第二次重復(fù)的25個穗中收集1000粒/cv

qPCR

-5個品種≈第二次復(fù)制的1000粒/cv

-研磨每個品種的所有果仁，并從50 mg面粉中提取DNA

-具有特定TaqMan的qPCR® F.graminearum的探針

結(jié)果

在不同生理期的不同個體麥穗和群體

% 結(jié)痂麥穗s & % FDK

 單個麥穗 &群體

‒ Videometer: 培養(yǎng)皿 & 傳送帶

‒ 360°C dpi評分 & 成熟 

VDA （360°C麥穗和麥粒成熟) 與Videometer在麥粒成熟度上有很強(qiáng)相關(guān)性，以下模塊：

‒單獨(dú)麥穗& 群體

‒ Videometer帶培養(yǎng)皿和傳送帶

在其它試驗(yàn)中，用F. graminearum接種，觀察到了Microdochium spp自然侵染的微弱相關(guān)性。

2.qPCR, VideometerLab® 和VDA的疾病評估相關(guān)性。

在qPCR 于帶傳送帶的Videometer 評估群體采集麥粒之間有高度相關(guān)性(R=0.91)，qPCR與 VDA 在 360°Cdpi也有高度相關(guān)性(R=0.95)，驗(yàn)證了VideometerLab® 在成熟階段麥粒精確評估、快速定量鐮刀菌的能力，這與抗性分類相一致。

結(jié)論與展望

使用VideometerLab®集合開發(fā)算法，在評價感染鐮刀菌（Fusarium graminearum）和culmorum 的抗性時取得了很好的結(jié)果。更多時間將在更多品系小麥以及谷物上進(jìn)行。針對該應(yīng)用還可開發(fā)更多的算法。