naica®數(shù)字PCR系統(tǒng)在高通量測定大麥花粉核減數(shù)分裂重組率的應(yīng)用

減數(shù)分裂通過產(chǎn)生單倍體細胞和基于同源重組（HR）產(chǎn)生的遺傳變異來支持有性生殖。HR通過重組交換(CO)、同源染色體之間的聯(lián)會，交換等來確保減數(shù)分裂染色體分離，同時保證遺傳變異在育種過程中發(fā)揮作用。
 

在植物中，同源重組可以通過幾種技術(shù)檢測到，例如通過減數(shù)分裂染色體分析進行細胞學檢測，通過測序進行基因分型和分離群體中的分子標記或熒光標記株系（FTLs）。FTLs在擬南芥中是測量花粉或種子中減數(shù)分裂重組事件的有力工具。但FTLs不適用于作物，因為在基因組特別大的作物中產(chǎn)生FTLs既費力又昂貴。此外，不同的作物或某些基因型不適合遺傳轉(zhuǎn)化。作為替代，使用小孢子(四分體或花粉核)基因分型或測序用于直接檢測減數(shù)分裂產(chǎn)物中減數(shù)分裂重組的結(jié)果。然而，作物小孢子的測序/基因分型相當昂貴，因此可以進行檢測的數(shù)量有限，特別是對于大基因組物種如谷物。
 

在受精前測量雄配子的減數(shù)分裂重組率有樣本量大，分子標記分析獨立和即時重組交換分析的優(yōu)勢，但配子DNA含量有限，測序/基因分型方法通常依賴于全基因組擴增(WGA)。而直接通過PCR反應(yīng)分析單個配子進行基因分型也由于單倍體配子的低DNA含量無法達成。在大麥中，單花粉核基因分型是通過熒光激活細胞分選從種內(nèi)雜種中分離出單個單倍體花粉核，然后進行WGA和多位點KASP基因分型或單細胞基因組測序完成的。單個單倍體花粉核的DNA有限，且WGA價格較高，導(dǎo)致分析樣品的數(shù)量有限，無法完成高通量的分析。
 

德國萊布尼茨植物遺傳和作物植物研究所的科學家近日在《The Plant Journal》上發(fā)表了一篇減數(shù)分裂重組率測量的相關(guān)文獻，該文章采用naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對配子中減數(shù)分裂重組率進行測量，實現(xiàn)高通量和低成本的基因分型。

使用基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的基因分型分析，無需大量預(yù)先進行的WGA就可完成對大麥花粉細胞核中減數(shù)分裂重組率的高通量測量。在取得花粉后，將花粉中的花粉核取出，并通過流式進行純化，將得到的花粉核加入naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的Mix中進行檢測，從而得到減數(shù)分裂重組率，通過對總共>42，000個單個花粉核進行基因分型(每株分析多達4900個核)，在雜交植物中測量了兩個著絲粒和兩個遠染色體間隔內(nèi)的減數(shù)分裂重組率�；ǚ酆酥写_定的重組頻率與分離群體中的檢測到的頻率接近。
 

▲ 圖1：用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)進行大麥單花粉核基因分型的工作流程。（a）雜交植物的花藥；(b)通過使用不同篩孔大小的過濾器(100和20微米)在懸浮液中分離花粉和花粉核。(c)花粉核用碘化丙錠染色，并流式分選到數(shù)字PCR反應(yīng)Mix中。(d)將25微升數(shù)字PCR反應(yīng)Mix(包括分選的花粉核)裝入sapphire芯片的四個腔室之一。(e)在Geode中進行液滴生成和熱循環(huán)。(f)在熱循環(huán)之后，在naica^® Prism 3中掃描sapphire芯片，然后在Crystal Miner軟件中進行數(shù)據(jù)分析

該文章在進行花粉核減數(shù)分裂重組率的檢測時采用雙探針法，如前期可行性驗證時檢測的InDel3118和InDel3135之間的區(qū)間Id 3-1，用HEX標記Barke (B)等位基因特異性探針(綠色)，用FAM標記Morex (M)等位基因特異性探針(藍色)(圖2b)，研究者將來自親本基因型的花粉核以1∶1的比例混合，同時也檢測了Id 3-1雜合的雜交植物的花粉核。在親本混合樣本檢測中，兩種親本基因型的液滴相等，兩種標記顯示相同的熒光(B的HEX或M的FAM)(圖2b)。在雜交材料樣本檢測中下，預(yù)計會出現(xiàn)代表重組事件的不同液滴群，即同時顯示兩種顏色的液滴(InDel3118為HEX，InDel3135為FAM，反之亦然)(圖2b)。在實際檢測中發(fā)現(xiàn)，親代基因型得到了數(shù)量大致相等的液滴，它們對兩種標記物顯示出相同的熒光(圖2d，e，綠色和藍色矩形)。在對雜交植物的花粉核的檢測中，檢測到具有兩種顏色(HEX和FAM)的液滴，表明重組事件(圖2e，紅色矩形)。此外，可以區(qū)分只有一個標記成功擴增的液滴(圖2d，e，簇I和iii)以及沒有任何擴增的液滴(圖2d，e，簇ii)。表明使用naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)對單個花粉核進行包裹和基因分型是完全可行的。
 

▲ 圖2。用naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)進行大麥花粉單核基因分型。(a)在大麥染色體1和3上定義四個染色體間隔的的InDel或單核苷酸多態(tài)性(SNP)標記。(b)以Id 3-1為例的基于naica®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的花粉核基因分型分析:兩種熒光探針的可能組合能夠區(qū)分重組和非重組花粉核。（c）有效微滴陣列原始視圖。每個腔室通常包含大約25000個穩(wěn)定的有效液滴。在任何通道(FAM或HEX)中成功擴增的液滴是淺灰色的，而暗灰色的液滴是陰性的。(d，e)來自芯片室的基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的花粉核基因分型數(shù)據(jù)，在軟件中顯示為來自以1:1比例混合的親本基因型的花粉核的點圖(d)和來自與Id 3-1雜合的雜交植物的花粉核的點圖。(e)通過兩個HEX標記的(綠色方框)或FAM標記的等位基因探針(藍色方框)將兩個非重組親代群體檢測為具有成功基因分型的微滴。在親代基因型混合物(d)的點狀圖中以灰色框表示HEX和FAM雙陽性微滴為假陽性+噪聲。雜交植物中HEX和FAM雙陽性微滴為包括假陽性和噪音在內(nèi)的重組群體，顯示為紅色方框(e)。簇(I)和(iii)代表僅成功擴增一種標記的微滴

naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)具有極高的分辨率，因此在那些成功擴增標記物的微滴中，也可以觀察到微滴內(nèi)的細胞核(圖2c)，研究者通過對微滴包裹核的數(shù)量分析進一步優(yōu)化實驗，通過用熱穩(wěn)定的限制性酶預(yù)處理花粉核來提高基因分型的效率，且因為細胞核數(shù)量與單個包裹細胞核的微滴數(shù)量呈正相關(guān)，提出上樣細胞核的最佳區(qū)間（不同物種的不同大小細胞核有差異）。
 

本文基于2色探針進行檢測是非常成功的，而進一步通過6色平臺可以同時進行更多組基因分型檢測，將獲得多重基因分型數(shù)據(jù)，也可以對相同或不同染色體上的一個以上染色體間隔的重組率進行平行測量，或者對CO干擾強度/存在的測量。
 

總的來說，基于naica^®微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)的單個大麥花粉核基因分型在種內(nèi)雜種植物的規(guī)定染色體間隔內(nèi)提供了可靠、快速和高精度的減數(shù)分裂重組測量。來自一系列具有不同細胞核和基因組大小的物種的細胞核的成功包裹表明，所提出的方法廣泛適用于單個細胞核的基因分型。
 

德國萊布尼茨植物遺傳與作物研究所(IPK)的Stefan Heckmann教授和Yun-Jae Ahn博士也給我們在線分享了他們的研究成果，想要直觀的去了解這篇文章的詳細內(nèi)容，請點擊https://mp.weixin.qq.com/s/KNXVs6rOt8MYpBjzuKZZ9A進行觀看哦。
 

本文鏈接：https://doi: 10.1111/tpj.15305

naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)

法國Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片數(shù)字PCR系統(tǒng)，源于Crystal微滴芯片數(shù)字PCR技術(shù)，自動化微滴生成和擴增，每個樣本孔可實現(xiàn)6熒光通道的檢測，智能化識別微滴并進行質(zhì)控，3小時內(nèi)即可獲得至少6個靶標基因的絕對拷貝數(shù)濃度。