自噬與細(xì)胞周期調(diào)控的新機(jī)制
自噬，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是細(xì)胞自己吃自己、廢物再利用。細(xì)胞陷于困境時(shí) (如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏)，啟動(dòng)自噬程序自救，通過(guò)降解蛋白質(zhì)和細(xì)胞器獲得必需的氨基酸、脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)維持基本生命活動(dòng)，以便死中求生。一直以來(lái)，自噬都是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
2020 年 8 月 17 日，圖盧茲大學(xué)綜合生物研究中心 Arnaud Besson 教授團(tuán)隊(duì)，在期刊 Nature cell biology 中發(fā)表的自噬相關(guān)文章 (圖 1)，闡明了自噬與細(xì)胞周期調(diào)控的新機(jī)制。
背景介紹
p27Kip1 (p27) 被認(rèn)為是細(xì)胞周期蛋白 CDK 的抑制因子，具有誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯的能力。營(yíng)養(yǎng)匱乏往往是自噬發(fā)生的主要誘導(dǎo)原因，已有研究表明，細(xì)胞質(zhì)中的 p27 是自噬的正調(diào)節(jié)劑 (葡萄糖匱乏或者血清剝奪的條件下)，它可以保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。但是，p27 調(diào)控自噬作用的具體分子機(jī)制仍然是未知的。
接下來(lái)，M 君和大家一起來(lái)看看，關(guān)于自噬調(diào)控，作者團(tuán)隊(duì)做了哪些精彩的工作。
p27 調(diào)控細(xì)胞自噬
作者團(tuán)隊(duì)通過(guò)研究 p27+/+ MEFs 和 p27-/- MEFs 應(yīng)對(duì)氨基酸剝奪后自噬的變化，證明了氨基酸缺乏的細(xì)胞中，p27 促進(jìn)自噬。
細(xì)胞：
p27+/+ MEFs: p27 野生型 (p27+/+) 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 (MEFs)，源于 p27 野生型小鼠胚胎。
p27+/+ MEFs: p27 缺失型 (p27-/-) MEFs，源于 p27 缺失的小鼠胚胎。
1、p27 促進(jìn)自噬發(fā)生
LC3B-II 是自噬小體的標(biāo)記物，位于自噬體膜，與溶酶體融合時(shí)被降解。氨基酸剝奪的短時(shí)間內(nèi)，如圖 2a 所示，p27+/+ 和 p27-/- 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，LC3B-II 表達(dá)水平相似，隨著氨基酸剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，p27-/- 中的 LC3B-II 表達(dá)水平明顯會(huì)更高，并且在 48 小時(shí)表現(xiàn)出顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (圖 2b)。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，選擇 48 小時(shí)作為氨基酸的長(zhǎng)時(shí)間剝奪的誘導(dǎo)時(shí)間。圖 2c 的 LC3B 的免疫熒光染色同樣也呼應(yīng)這一觀察結(jié)果 (紅色箭頭)。這表明 p27 可促進(jìn)氨基酸剝奪細(xì)胞中的自噬。
圖 2. 氨基酸剝奪不同時(shí)間，細(xì)胞中 LC3B，LC3B-I 和 LC3B-II 的表達(dá)【a-b: 指定時(shí)間段內(nèi)氨基酸缺失的 p27+/+和 p27-/-MEFs 的 LC3B-I 和 LC3B-II 的表達(dá)和定量分析；c-d: p27+/+ 和 p27-/- MEFs 在 0 h 和氨基酸剝奪 48 h 后 LC3B（綠色熒光）免疫熒光染色和定量分析】
2、p27 調(diào)控自噬流的檢測(cè)
自噬是一個(gè)多步驟的動(dòng)態(tài)過(guò)程，當(dāng)應(yīng)答營(yíng)養(yǎng)匱乏的壓力時(shí) (如氨基酸或葡萄糖缺乏)，細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號(hào)，隨后會(huì)在胞漿處形成一種扁平的叫做吞噬泡 (Phagophore) 的雙層膜結(jié)構(gòu)。緊接著，吞噬泡不斷延伸，包裹一些細(xì)胞元件或者自噬物 (Autophagic cargo)，形成密閉的球狀的自噬小體 (Autophagosome)。自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體 (Autolysosome)，自噬體中的內(nèi)容物被溶酶體中的酶降解，降解產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)被細(xì)胞重新利用。
在整個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞將自噬物吞噬到自噬小體，直到最后自噬溶酶體形成并降解自噬物的這個(gè)過(guò)程被稱為自噬流 (Autophagic flux) (圖 3)。自噬流中的任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙自噬都無(wú)法完成其生物學(xué)功能。
上文已經(jīng)說(shuō)到 LC3B-II 通常是自噬小體的 Marker，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi) LC3B 的總量通常不會(huì)有巨大波動(dòng)，一般只會(huì)出現(xiàn) LC3B-I 和 LC3B-II 間的相互轉(zhuǎn)換。
如果 LC3B-II 表達(dá)增加，可能是由于前期自噬活化后自噬小體增多導(dǎo)致的，也可能是后期自噬溶酶體清除失敗使其積累所致。因此，某單一時(shí)間點(diǎn)的 LC3B-II 的表達(dá)改變并不能體現(xiàn)自噬流的改變。
在文章中，使用了 WB 檢測(cè)蛋白、免疫熒光，mCherry-eGFP-LC3B 雙熒光系統(tǒng)的組合測(cè)量方法，檢測(cè) p27+/+ 和 p27-/- MEFs 自噬流。
(1) 氯喹 (Chloroquine，CQ) 處理，檢測(cè)自噬流中 LC3B-II 變化
在酸性溶酶體中，氯喹會(huì)使溶酶體 pH 值升高，使溶酶體中酸性水解酶失活 ，從而抑制細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體的融合與降解。氯喹處理細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致 LC3B-II 的聚集，此時(shí)觀察到的 LC3B-II 的變化僅代表自噬小體數(shù)量的改變。
氯喹處理細(xì)胞后，在短期氨基酸剝奪的條件下 (0-4 h)，兩種細(xì)胞的自噬通量是相似的 (圖 4a, b)。但是隨著時(shí)間的增加，長(zhǎng)時(shí)間的氨基酸剝奪處理后，p27-/- MEFs 與 p27+/+ MEFs 相比，LC3B-II 數(shù)量顯著降低 (圖 4c, d)。這說(shuō)明 p27 促進(jìn)氨基酸缺失細(xì)胞中自噬通量。
(2) p62/SQSTM1 在細(xì)胞中的積累
p62 也稱為 SQSTM1 蛋白，作為一種調(diào)節(jié)因子參與自噬體的構(gòu)成，具有底物的特異性，是連接 LC3B-II 與待降解泛素化底物的橋梁。p62 結(jié)合泛素化蛋白進(jìn)入到自噬體后最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體從而得到清除 (圖 5a)。自噬流被抑制時(shí)，p62/SQSTM1 會(huì)在自噬流受損的細(xì)胞中積累, 在細(xì)胞內(nèi)整體 p62 水平的表達(dá)與自噬活性存在負(fù)相關(guān)。
如圖 5 b 所示，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，p62 在氨基酸缺乏的 p27-/- 細(xì)胞中的表達(dá)量更高，p27-/- 細(xì)胞的自噬流受損，這進(jìn)一步說(shuō)明了，p27 可以促進(jìn)自噬流活化。
(3) mCherry-eGFP-LC3B 雙熒光系統(tǒng)檢測(cè)自噬體與自噬溶酶體。
mCherry (紅光)-eGFP (綠光)-LC3B 串聯(lián)熒光蛋白可用于檢測(cè)自噬流水平的融合蛋白。它利用了酸性自溶酶體和中性自噬體之間的 pH 差異以及不同熒光素對(duì) pH 的敏感性差異，以監(jiān)控從自噬體到自溶酶體的進(jìn)程 (圖 6a)。
如圖 6a-b，mCherry 熒光基團(tuán)的 pH 值穩(wěn)定性比 GFP 高，GFP 熒光信號(hào)在進(jìn)入溶酶體后由于 pH 值的下降會(huì)出現(xiàn)淬滅，而 mCherry 熒光基團(tuán)進(jìn)入溶酶體后仍能發(fā)出熒光。因此若細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠和紅色熒光共定位，即出現(xiàn)黃色熒光時(shí)，表明：mCherry-eGFP-LC3B 融合蛋白并未與溶酶體發(fā)生融合, 說(shuō)明了自噬流被阻斷。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)僅出現(xiàn)紅色熒光而無(wú)綠色熒光時(shí)，代表 mCherry-eGFP-LC3B 融合蛋白定位于溶酶體或自噬溶酶體內(nèi)，即自噬流活化。
與 p27+/+ 細(xì)胞相比，p27-/- 細(xì)胞中自噬溶酶體的比例下降 (72% vs 95%)，進(jìn)一步表明 p27 促進(jìn)自噬流 (圖 6b-c)。
(4) p27 促進(jìn)自噬體成熟
之前有文獻(xiàn)表明 (參考文獻(xiàn) 5)，自噬體在成熟過(guò)程中，LC3B 陽(yáng)性自噬囊泡會(huì)聚集在細(xì)胞核周圍形成環(huán)狀聚集結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是自噬體成熟過(guò)程中的中間結(jié)構(gòu)。如圖 7a 所示，p27+/+ 細(xì)胞中有明顯的環(huán)狀聚集體，但是在 p27-/- 細(xì)胞中很少觀察到，取而代之的是小囊泡結(jié)構(gòu)。這表明 p27 可促進(jìn)自噬體成熟過(guò)程。
總結(jié)
1、在長(zhǎng)期氨基酸剝奪的情況下，與 p27-/- 細(xì)胞相比，p27+/+ 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中 LC3B-II 的上調(diào)，p62 蛋白表達(dá)量減少，自噬溶酶體數(shù)目比例增加，以及自噬體成熟過(guò)程環(huán)狀聚集體的形成，可以證明 p27 在氨基酸長(zhǎng)期匱乏的細(xì)胞中促進(jìn)自噬流活化。
2、自噬流在細(xì)胞內(nèi)是流動(dòng)的細(xì)胞代謝過(guò)程, 自噬流中的任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙自噬將無(wú)法完成其生物學(xué)功能。尚無(wú)某種單一方法可以絕對(duì)準(zhǔn)確特異的檢測(cè)自噬，因此應(yīng)該使用組合的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)評(píng)估自噬活動(dòng) (自噬相關(guān)工具藥物的使用，WB 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白變化，免疫熒光共定位，以及 mCherry-eGFP-LC3B 雙熒光檢測(cè)等)。
3、足夠的實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)，合適的實(shí)驗(yàn)對(duì)照，樂(lè)觀的心態(tài)也是實(shí)驗(yàn)成功的必要因素，M 君祝大家開學(xué)伊始，實(shí)驗(yàn)旗開得勝。
原文鏈接：DOI: 10.1038/s41556-020-0554-4.
2020 年 8 月 17 日，圖盧茲大學(xué)綜合生物研究中心 Arnaud Besson 教授團(tuán)隊(duì)，在期刊 Nature cell biology 中發(fā)表的自噬相關(guān)文章 (圖 1)，闡明了自噬與細(xì)胞周期調(diào)控的新機(jī)制。
圖 1. p27 調(diào)控自噬-溶酶體途徑，協(xié)調(diào)細(xì)胞周期和生長(zhǎng)
背景介紹
p27Kip1 (p27) 被認(rèn)為是細(xì)胞周期蛋白 CDK 的抑制因子，具有誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯的能力。營(yíng)養(yǎng)匱乏往往是自噬發(fā)生的主要誘導(dǎo)原因，已有研究表明，細(xì)胞質(zhì)中的 p27 是自噬的正調(diào)節(jié)劑 (葡萄糖匱乏或者血清剝奪的條件下)，它可以保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。但是，p27 調(diào)控自噬作用的具體分子機(jī)制仍然是未知的。
接下來(lái)，M 君和大家一起來(lái)看看，關(guān)于自噬調(diào)控，作者團(tuán)隊(duì)做了哪些精彩的工作。
p27 調(diào)控細(xì)胞自噬
作者團(tuán)隊(duì)通過(guò)研究 p27+/+ MEFs 和 p27-/- MEFs 應(yīng)對(duì)氨基酸剝奪后自噬的變化，證明了氨基酸缺乏的細(xì)胞中，p27 促進(jìn)自噬。
細(xì)胞：
p27+/+ MEFs: p27 野生型 (p27+/+) 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 (MEFs)，源于 p27 野生型小鼠胚胎。
p27+/+ MEFs: p27 缺失型 (p27-/-) MEFs，源于 p27 缺失的小鼠胚胎。
1、p27 促進(jìn)自噬發(fā)生
LC3B-II 是自噬小體的標(biāo)記物，位于自噬體膜，與溶酶體融合時(shí)被降解。氨基酸剝奪的短時(shí)間內(nèi)，如圖 2a 所示，p27+/+ 和 p27-/- 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，LC3B-II 表達(dá)水平相似，隨著氨基酸剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，p27-/- 中的 LC3B-II 表達(dá)水平明顯會(huì)更高，并且在 48 小時(shí)表現(xiàn)出顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (圖 2b)。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，選擇 48 小時(shí)作為氨基酸的長(zhǎng)時(shí)間剝奪的誘導(dǎo)時(shí)間。圖 2c 的 LC3B 的免疫熒光染色同樣也呼應(yīng)這一觀察結(jié)果 (紅色箭頭)。這表明 p27 可促進(jìn)氨基酸剝奪細(xì)胞中的自噬。
圖 2. 氨基酸剝奪不同時(shí)間，細(xì)胞中 LC3B，LC3B-I 和 LC3B-II 的表達(dá)【a-b: 指定時(shí)間段內(nèi)氨基酸缺失的 p27+/+和 p27-/-MEFs 的 LC3B-I 和 LC3B-II 的表達(dá)和定量分析；c-d: p27+/+ 和 p27-/- MEFs 在 0 h 和氨基酸剝奪 48 h 后 LC3B（綠色熒光）免疫熒光染色和定量分析】
2、p27 調(diào)控自噬流的檢測(cè)
自噬是一個(gè)多步驟的動(dòng)態(tài)過(guò)程，當(dāng)應(yīng)答營(yíng)養(yǎng)匱乏的壓力時(shí) (如氨基酸或葡萄糖缺乏)，細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號(hào)，隨后會(huì)在胞漿處形成一種扁平的叫做吞噬泡 (Phagophore) 的雙層膜結(jié)構(gòu)。緊接著，吞噬泡不斷延伸，包裹一些細(xì)胞元件或者自噬物 (Autophagic cargo)，形成密閉的球狀的自噬小體 (Autophagosome)。自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體 (Autolysosome)，自噬體中的內(nèi)容物被溶酶體中的酶降解，降解產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)會(huì)被細(xì)胞重新利用。
在整個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞將自噬物吞噬到自噬小體，直到最后自噬溶酶體形成并降解自噬物的這個(gè)過(guò)程被稱為自噬流 (Autophagic flux) (圖 3)。自噬流中的任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙自噬都無(wú)法完成其生物學(xué)功能。
圖 3. 細(xì)胞應(yīng)答營(yíng)養(yǎng)匱乏壓力時(shí)，自噬發(fā)生的示意圖[2]
【吞噬泡 (Phagophore)-自噬小體 (Autophagosome)-自噬溶酶體 (Autolysosome)】上文已經(jīng)說(shuō)到 LC3B-II 通常是自噬小體的 Marker，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi) LC3B 的總量通常不會(huì)有巨大波動(dòng)，一般只會(huì)出現(xiàn) LC3B-I 和 LC3B-II 間的相互轉(zhuǎn)換。
如果 LC3B-II 表達(dá)增加，可能是由于前期自噬活化后自噬小體增多導(dǎo)致的，也可能是后期自噬溶酶體清除失敗使其積累所致。因此，某單一時(shí)間點(diǎn)的 LC3B-II 的表達(dá)改變并不能體現(xiàn)自噬流的改變。
在文章中，使用了 WB 檢測(cè)蛋白、免疫熒光，mCherry-eGFP-LC3B 雙熒光系統(tǒng)的組合測(cè)量方法，檢測(cè) p27+/+ 和 p27-/- MEFs 自噬流。
(1) 氯喹 (Chloroquine，CQ) 處理，檢測(cè)自噬流中 LC3B-II 變化
在酸性溶酶體中，氯喹會(huì)使溶酶體 pH 值升高，使溶酶體中酸性水解酶失活 ，從而抑制細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體的融合與降解。氯喹處理細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致 LC3B-II 的聚集，此時(shí)觀察到的 LC3B-II 的變化僅代表自噬小體數(shù)量的改變。
氯喹處理細(xì)胞后，在短期氨基酸剝奪的條件下 (0-4 h)，兩種細(xì)胞的自噬通量是相似的 (圖 4a, b)。但是隨著時(shí)間的增加，長(zhǎng)時(shí)間的氨基酸剝奪處理后，p27-/- MEFs 與 p27+/+ MEFs 相比，LC3B-II 數(shù)量顯著降低 (圖 4c, d)。這說(shuō)明 p27 促進(jìn)氨基酸缺失細(xì)胞中自噬通量。
圖 4. 氯喹影響細(xì)胞 LC3B-II 的表達(dá)
【a-b: p27+/+ 和 p27-/- MEFs 中，aa-剝奪 0 h、1 h、4 h 后 (有或無(wú)氯喹處理) , LC3B-II 的表達(dá)和不同細(xì)胞中自噬流變化的定量分析 (LC3B-II+CQ/actin)/(LC3B-II-CQ/actin)；c-d: aa-剝奪 0 h、48 h 后，LC3B-II 的表達(dá)和自噬流變化的定量分析】(2) p62/SQSTM1 在細(xì)胞中的積累
p62 也稱為 SQSTM1 蛋白，作為一種調(diào)節(jié)因子參與自噬體的構(gòu)成，具有底物的特異性，是連接 LC3B-II 與待降解泛素化底物的橋梁。p62 結(jié)合泛素化蛋白進(jìn)入到自噬體后最終與溶酶體融合形成自噬溶酶體從而得到清除 (圖 5a)。自噬流被抑制時(shí)，p62/SQSTM1 會(huì)在自噬流受損的細(xì)胞中積累, 在細(xì)胞內(nèi)整體 p62 水平的表達(dá)與自噬活性存在負(fù)相關(guān)。
如圖 5 b 所示，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，p62 在氨基酸缺乏的 p27-/- 細(xì)胞中的表達(dá)量更高，p27-/- 細(xì)胞的自噬流受損，這進(jìn)一步說(shuō)明了，p27 可以促進(jìn)自噬流活化。
圖 5. p62 在自噬流受損的細(xì)胞中積累
【a: p62 參與自噬體的構(gòu)成[3]；b: aa-剝奪 0 h 或 48 h，p62 和 Vinculin (Loading control) WB 結(jié)果；c: p62 歸一化的定量分析�！�(3) mCherry-eGFP-LC3B 雙熒光系統(tǒng)檢測(cè)自噬體與自噬溶酶體。
mCherry (紅光)-eGFP (綠光)-LC3B 串聯(lián)熒光蛋白可用于檢測(cè)自噬流水平的融合蛋白。它利用了酸性自溶酶體和中性自噬體之間的 pH 差異以及不同熒光素對(duì) pH 的敏感性差異，以監(jiān)控從自噬體到自溶酶體的進(jìn)程 (圖 6a)。
圖 6. 串聯(lián)熒光探針及熒光共定位檢測(cè)自噬流
【a: mCherry-eGFP-LC3B 串聯(lián)熒光探針示意圖與機(jī)制[6]；b: p27+/+ 和p27-/- MEFs 中，0 h 或 aa-剝奪 48 h 時(shí)，mCherry-eGFP-LC3B 示蹤自噬體以及與自噬溶酶體形成；c: 自噬小體 (黃色) 和自噬溶酶體 (紅色) 的定量分析】如圖 6a-b，mCherry 熒光基團(tuán)的 pH 值穩(wěn)定性比 GFP 高，GFP 熒光信號(hào)在進(jìn)入溶酶體后由于 pH 值的下降會(huì)出現(xiàn)淬滅，而 mCherry 熒光基團(tuán)進(jìn)入溶酶體后仍能發(fā)出熒光。因此若細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)綠和紅色熒光共定位，即出現(xiàn)黃色熒光時(shí)，表明：mCherry-eGFP-LC3B 融合蛋白并未與溶酶體發(fā)生融合, 說(shuō)明了自噬流被阻斷。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)僅出現(xiàn)紅色熒光而無(wú)綠色熒光時(shí)，代表 mCherry-eGFP-LC3B 融合蛋白定位于溶酶體或自噬溶酶體內(nèi)，即自噬流活化。
與 p27+/+ 細(xì)胞相比，p27-/- 細(xì)胞中自噬溶酶體的比例下降 (72% vs 95%)，進(jìn)一步表明 p27 促進(jìn)自噬流 (圖 6b-c)。
(4) p27 促進(jìn)自噬體成熟
圖 7. p27 促進(jìn)自噬體成熟過(guò)程的中間體形成
【a: p27+/+ 和 p27-/- MEFs 中，0 h 或 aa-剝奪 48 h 時(shí), LC3B 和 p62 的免疫染色 (虛線描繪了 LC3B 陽(yáng)性環(huán)狀結(jié)構(gòu))；b: p27+/+ 和p27-/- MEFs 中 LC3B 環(huán)狀聚集物的定量�！� 之前有文獻(xiàn)表明 (參考文獻(xiàn) 5)，自噬體在成熟過(guò)程中，LC3B 陽(yáng)性自噬囊泡會(huì)聚集在細(xì)胞核周圍形成環(huán)狀聚集結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是自噬體成熟過(guò)程中的中間結(jié)構(gòu)。如圖 7a 所示，p27+/+ 細(xì)胞中有明顯的環(huán)狀聚集體，但是在 p27-/- 細(xì)胞中很少觀察到，取而代之的是小囊泡結(jié)構(gòu)。這表明 p27 可促進(jìn)自噬體成熟過(guò)程。
總結(jié)
1、在長(zhǎng)期氨基酸剝奪的情況下，與 p27-/- 細(xì)胞相比，p27+/+ 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中 LC3B-II 的上調(diào)，p62 蛋白表達(dá)量減少，自噬溶酶體數(shù)目比例增加，以及自噬體成熟過(guò)程環(huán)狀聚集體的形成，可以證明 p27 在氨基酸長(zhǎng)期匱乏的細(xì)胞中促進(jìn)自噬流活化。
2、自噬流在細(xì)胞內(nèi)是流動(dòng)的細(xì)胞代謝過(guò)程, 自噬流中的任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)障礙自噬將無(wú)法完成其生物學(xué)功能。尚無(wú)某種單一方法可以絕對(duì)準(zhǔn)確特異的檢測(cè)自噬，因此應(yīng)該使用組合的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)評(píng)估自噬活動(dòng) (自噬相關(guān)工具藥物的使用，WB 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白變化，免疫熒光共定位，以及 mCherry-eGFP-LC3B 雙熒光檢測(cè)等)。
3、足夠的實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)，合適的實(shí)驗(yàn)對(duì)照，樂(lè)觀的心態(tài)也是實(shí)驗(yàn)成功的必要因素，M 君祝大家開學(xué)伊始，實(shí)驗(yàn)旗開得勝。
原文鏈接：DOI: 10.1038/s41556-020-0554-4.
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| Hoechst 33342 | 發(fā)藍(lán)色熒光的 DNA 染料，可以透過(guò)細(xì)胞膜。 |
| E64d | 溶酶體蛋白酶抑制劑，可用于自噬流檢測(cè)。 |
| Leupeptin | 溶酶體蛋白酶抑制劑，可用于自噬流檢測(cè)。 |
| Pepstatin A | 溶酶體蛋白酶抑制劑，可用于自噬流檢測(cè)。 |
| 自噬激活劑 | 包含 Rapamycin，MG-132 等 600+ 種有效的自噬激活劑。 |
| 自噬抑制劑 | 包含 3-Methyladenine (3-MA) ，Resatorvid (TAK-242) 等近 200 種有效的自噬抑制劑。 |
| 自噬化合物庫(kù) | 收錄了 900+ 種自噬信號(hào)通路相關(guān)的產(chǎn)品，是研究自噬相關(guān)調(diào)控及疾病的有用工具。 |
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細(xì)胞程序性死亡
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