關(guān)于HPLC方法開發(fā)的幾個重要問答（Q&A）

Q1：HPLC方法開發(fā)中最大的挑戰(zhàn)是什么？

A1：最大的挑戰(zhàn)有兩個。第一是化合物之間的分離度問題，色譜分析的前提是分離，只有充分分離才能精確地定量（使用MS作為檢測器時對于非同分異構(gòu)體等情況例外）；第二是分析物色譜峰的峰形，當峰形不佳的時候（可以用拖尾因子、柱效等來衡量），也會影響分析物的定量和分離。

Q2：有哪些方法可以解決分離度的問題？

A2：1990年研究人員對這個問題進行了系統(tǒng)的研究，認為分離度Rs主要由三個因素決定，也就是柱效N，選擇性α和保留因子k（如下圖）。這些年來的很多技術(shù)革新都是通過提高N來提高分離度，比如設(shè)計了核殼硅膠作為色譜柱填料基質(zhì)或者用UPLC儀器搭配小粒徑（亞2 μm）顆粒填料。但更根本和有效的途徑是通過改變選擇性來實現(xiàn)分離，也就是改變難分離的化合物與固定相和流動相之間的作用力，從下圖中也可以看到，通過改變選擇性可以有效改善分離度。

Q3：有哪些方法可以改變選擇性？

A3：改變選擇性的方法同樣很多。最重要的就是從三個角度出發(fā)：分析物本身、流動相以及固定相。對于可離子化的分析物，根據(jù)化合物的pKa針對性地改變流動相pH可以有效改變選擇性；另外，由于常用的溶劑（正相中的乙醇、異丙醇，反相中的甲醇、乙腈）之間的在氫鍵、極性作用等的差異比較大，因此改變流動相時常常也會有效改善選擇性；另外，可以根據(jù)難分離的化合物之間的差異，針對性地選擇可以識別這些差異的色譜柱，比如π-π作用、氫鍵作用、偶極-偶極作用、疏水作用、離子交換作用、形狀選擇性等，通過選擇合適的色譜柱往往也能達到出奇制勝的效果。

Q4：峰形問題有哪些原因和解決辦法？

A4：解決峰形問題最關(guān)鍵的是找對原因。造成峰形問題的原因有很多，但是大部分是化合物本身的原因，比如含有與固定相產(chǎn)生強作用的基團（如含N的堿性基團、螯合基團等），或者含有在某些流動相條件下會互變的基團等。至于解決辦法，就需要對癥下藥，比如對于前者就需要在流動相中加入添加劑或者選擇更“惰性”的柱子，對于后者就需要選擇更合適的流動相條件。

Q5：星譜科技所提供的色譜柱有哪些優(yōu)勢？

A5：星譜科技目前主要提供英國Horizon公司的色譜柱，這些色譜柱的主要優(yōu)勢有三個：第一，它的多款色譜柱具有獨特的選擇性，在解決分離度問題方面很有優(yōu)勢，比如C18/AR、C18/PFP和amide 18等復(fù)合型固定相設(shè)計，可以在保留C18疏水性的基礎(chǔ)上引入比如π-π作用、氫鍵作用、偶極-偶極作用等；第二，幾乎所有的這些鍵合固定相都有核殼硅膠基質(zhì)類型填料可供選擇，保證在好的選擇性的同時具有高柱效，從而獲得更好的分離度；第三，Horizon色譜柱選擇的硅膠都是超純、超惰性的硅膠，可以盡量降低因分析物和硅膠表面的作用而造成的峰形問題。總結(jié)來說，Horizon色譜柱是解決色譜分析中分離度和峰形問題的利器。同時，星譜科技的技術(shù)人員對色譜柱也有深刻的理解，因此可以根據(jù)用戶的具體項目需要更精準地推薦色譜柱，節(jié)約方法開發(fā)的時間。