行為學(xué)實驗手冊丨學(xué)習(xí)記憶之恐懼記憶（2）

上一期，我們通過了解動物恐懼記憶相關(guān)的兩種研究——穿梭實驗與跳臺實驗，探究了通過特定的場景刺激（強光、電流和聲音等）使小鼠產(chǎn)生恐懼記憶，經(jīng)過一定時間強化后，環(huán)境與刺激兩者被小鼠聯(lián)系在一起，當小鼠再次回到該環(huán)境中便會出現(xiàn)恐懼相關(guān)行為的兩種實驗流程。

本期，我們將繼續(xù)介紹兩種研究小鼠恐懼記憶的測試——避暗實驗與巴恩斯迷宮實驗，探究動物大腦儲存恐懼記憶的奧秘。

01.原理

利用鼠類的嗜暗習(xí)性設(shè)計，主要測試動物對明暗辨別覺的學(xué)習(xí)記憶能力。動物由于嗜暗習(xí)性而偏好進入和停留在暗室，當動物進入暗室或停留暗室時則會受到電擊，動物為了避免受到電擊傷害就會尋找安全區(qū)（明室），經(jīng)幾次反復(fù)后，最終記住安全區(qū)域。

02.實驗材料
 

03.實驗方法

適應(yīng)期

實驗開始前3-7天，每天抓取、輕撫動物，讓其適應(yīng)被實驗人員抓取，避免實驗過程中因?qū)嶒炄藛T抓取而造成動物處于應(yīng)激狀態(tài)，造成實驗結(jié)果不可靠的問題。

建模期

① 時間：第一天② 強度：

• 大鼠：電流：0.65-1.8mA（推薦0.8mA），或，電壓65-70V。
• 小鼠：電流：0.15-0.6mA（推薦0.25mA），或，電壓30-36V。

③ 頻率：5-15Hz電流。

④ 刺激方法：實驗開始前，將動物放入暗箱，適應(yīng)5分鐘。隨后對暗箱進行通電，持續(xù)5分鐘，此時明箱底部沒有通電。

測試期

① 時間：第二天② 方法：將動物放進明箱，不進行通電，記錄5分鐘。

04.數(shù)據(jù)分析

①物活動軌跡，動物第一次進入暗箱的時間（潛伏期），分別在兩個箱體的活動時間，活動距離。

② P<0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。

05.注意事項

• 選擇體重均勻動物進行實驗，測試時大鼠體重需<300g，確保體重不影響電擊效果。
• 不同品系動物本身會有區(qū)別，常規(guī)推薦使用C57BL/6J小鼠和SD大鼠。
• 實驗前后注意清理電擊柵欄中的動物排泄物（排泄物會影響通電性及損壞電發(fā)生器）。
• 環(huán)境清理，通過酒精擦拭、晾干盡可能去除上一只動物氣味，儀器設(shè)備具有通風(fēng)性。

01.原理

1979年，Barnes 建立了巴恩斯迷宮，與水迷宮和放射臂迷宮類似，它是基于嚙齒類動物天生的探索特性，應(yīng)用噪音、強光和暴露的開放環(huán)境作為應(yīng)激手段，促使動物尋找目標洞。經(jīng)過訓(xùn)練，動物學(xué)習(xí)并記憶目標箱的位置。該實驗的優(yōu)點在于對動物的應(yīng)激性刺激較小，既不像放射臂迷宮那樣需要禁食，也不像水迷宮那樣應(yīng)激性強。因此，在記憶研究中較為常用。尤其適用于與應(yīng)激相關(guān)的記憶研究以及基因敲除小鼠的行為表型研究。

02.實驗材料

巴恩斯迷宮，smart3.0

03.實驗方法

① 實驗開始前3-7天，每天抓取、輕撫動物，讓其適應(yīng)被實驗人員抓取，避免實驗過程中因?qū)嶒炄藛T抓取而造成動物處于應(yīng)激狀態(tài)，造成實驗結(jié)果不可靠的問題。② 實驗第1天，將動物從目標孔洞放入目標箱內(nèi)適應(yīng)4分鐘（只進行這一次）。③ 實驗第2-7天，將動物移動至平臺中央，用透明圓筒限制活動5秒，后撤掉圓筒開始計時，同時給與動物刺激（強光，聲音等）。

• 動物成功進入目標箱，則讓動物在目標箱內(nèi)停留30秒。
• 若動物4分鐘內(nèi)沒有找到目標箱，則誘導(dǎo)動物進入目標箱，停留30秒。

④ 隨機轉(zhuǎn)動圓盤，使孔位與上一次實驗不同，但目標箱的方位始終保持不變。每天重復(fù)2次上一步的實驗流程。

04.數(shù)據(jù)分析

① 第一次探究洞的潛伏期，到達目標洞的時間，每只動物的錯誤次數(shù)（探究一個錯誤的洞即視為錯誤一次）。

• 潛伏期僅做參考，潛伏期越短，說明動物學(xué)會了迷宮原理，記憶水平越好。
• 到達目標洞的時間越短，說明動物記憶水平越好。
• 動物錯誤次數(shù)越多，說明動物學(xué)會了迷宮原理，但沒有記住目標箱的位置。

② 采用單因素方差分析（one way-ANOVA），當多組間有差異時，兩兩比較采用Fisher's LSD post hoc多重比較方法。

③P<0.05認為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。

05.注意事項

• 每只動物實驗結(jié)束后應(yīng)進行環(huán)境清理，盡可能去除上一只動物的氣味。
• 不同品系動物對此實驗的偏好性有很大不同，建議使用C57BL/6J小鼠進行實驗。

 

【參考文獻】

Rosenfeld Cheryl S,Ferguson Sherry A,Barnes maze testing strategies with small and large rodent models.[J] .J Vis Exp, 2014, undefined: e51194.

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