抗生素分類及轉(zhuǎn)染與抗性篩選

 
 
抗生素是一組用于抑制微生物生長或者殺死微生物的藥物，一般用來抑制感染，例如我們生活中十分熟悉的青霉素、紅霉素、頭孢菌素等等就是典型的抗生素�？股�素的發(fā)現(xiàn)大大改善了炎癥和感染，但是由于細(xì)菌變得越來越聰明，問題也隨之而來，那就是抗生素的耐藥性。

 

圖 1. 抗生素按照作用機(jī)制分類^[1]

 

   
轉(zhuǎn)染 (Transfection) 是真核細(xì)胞主動或被動導(dǎo)入外源核酸片段而獲得新表型的過程，引入的遺傳物質(zhì) (DNA 和 RNA) 穩(wěn)定或暫時(shí)存在于細(xì)胞中，據(jù)此，轉(zhuǎn)染可分為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
 
 
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：引入的遺傳物質(zhì)常帶選擇性標(biāo)記基因，它們被整合到宿主的基因組中，即使在宿主細(xì)胞分裂傳代后也能維持轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。即穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞系通過一些選擇性標(biāo)記反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：引入的遺傳物質(zhì)僅在有限的時(shí)間內(nèi)表達(dá)，并且不會整合到基因組中。遺傳物質(zhì)也會因環(huán)境因素和細(xì)胞分裂而丟失，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染維持時(shí)間較短，需盡快在蛋白或基因水平進(jìn)行相應(yīng)的檢測。
 

圖 2. 兩種不同的轉(zhuǎn)染方式^[4]
A. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染; B. 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

 

 
關(guān)于抗生素抗性篩選：攜帶抗生素抗性標(biāo)記的載體進(jìn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞在含有抗生素的選擇培養(yǎng)基中生長，而不帶有抗性基因的細(xì)胞會被抗生素殺死，最后獲得穩(wěn)定的帶抗性細(xì)胞株。因此，抗生素抗性標(biāo)記是區(qū)分穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的有效方法。
  

在原核/真核生物轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中常用的抗生素有很多，例如嘌呤霉素、G418、卡那霉素、四環(huán)素和博來霉素等等。

 
■ 嘌呤霉素 (Puromycin)

嘌呤霉素是一種氨基核苷類抗生素，是真核和原核生物中蛋白質(zhì)翻譯的有效抑制劑。如圖 3 所示，嘌呤霉素通過模擬氨�；� tRNA (aa-tRNA) 的 3' 末端，代替正常氨基酸參與翻譯延長過程。它通過核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶中心 (PTC) 催化摻入新生鏈的 C 末端，阻止進(jìn)一步延伸，導(dǎo)致翻譯過早的終止，從而抑制了蛋白質(zhì)合成。

 

圖 3. 嘌呤霉素的作用機(jī)制^[6]

 

編碼嘌呤霉素抗性的基因——嘌呤霉素 N-乙酰轉(zhuǎn)移酶 (PAC) 的 pac 基因，是從 Streptomyces alboniger 中分離出來的，早在 1988 年，PAC 就首次被用作分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞系的顯性選擇標(biāo)記。

 

Mikołaj Słabicki 等在 Nature 上發(fā)表的 Small-molecule-induced polymerization triggers degradation of BCL6 中使用嘌呤霉素篩選抗性的 HEK293T_Cas9 細(xì)胞。首先將 HEK293T_Cas9 細(xì)胞進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，然后再用嘌呤霉素孵育進(jìn)行篩選。因低濃度的嘌呤霉素對活細(xì)胞具有毒性，所以篩選后存活下來的細(xì)胞即具有嘌呤霉素抗性。Yunhao Chen 等在 Mol Cancer 上發(fā)表的 WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1 中，也是選取了 4 個(gè)細(xì)胞系，在用慢病毒轉(zhuǎn)染后，用嘌呤霉素感染細(xì)胞 1 周或更長時(shí)間，通過 RT-qPCR 和 WB 分析確定轉(zhuǎn)染的效率。

 

圖 4. 嘌呤霉素抗性細(xì)胞篩選過程

 
■ G418
G418，一種氨基糖苷類抗生素，由細(xì)菌 Micro-monospora rhodorangea 產(chǎn)生，其結(jié)構(gòu)與新霉素、慶大霉素和卡那霉素類似。G418 的抗性是由來自 Tn5 的編碼氨基糖苷 3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶 APH 3' II 的新霉素抗性基因 (neo) 介導(dǎo)的。與只對原核生物有作用的新霉素不同，G418 對細(xì)菌、酵母、原生動物、蠕蟲和哺乳動物細(xì)胞均具有廣泛的毒性。G418 與細(xì)胞中的 70S 或者 80S 核糖體進(jìn)行不可逆的結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)延伸，進(jìn)而阻斷了多肽的合成。
 

 

圖 5. G418 抗性細(xì)胞篩選過程^[14]

注: 只有經(jīng)轉(zhuǎn)座子 Tn5 或 Tn601 的 neo 基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可獲得對 G418 的抗性；G418 的有效濃度因細(xì)胞的生長培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和代謝率而異。
 
■ 卡那霉素 (Bekanamycin)
卡那霉素，一種廣譜氨基糖苷類抗生素，可以從細(xì)菌 Streptomyces kanamyceticus 中分離出來�？�那霉素與 30S 核糖體亞基中的 16S rRNA 受體不可逆結(jié)合后，會影響 mRNA 密碼子向氨基酸的翻譯，引起 mRNA 的誤讀或易位抑制，從而抑制蛋白質(zhì)合成(圖 6B)。
 

 

■ 四環(huán)素 (Tetracycline)

四環(huán)素，是一種廣譜的抗生素，對多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌、非典型生物如衣原體、支原體和立克次體以及原生動物寄生蟲具有活性。如圖 7，四環(huán)素與細(xì)菌核糖體的 30S 亞基可逆結(jié)合，抑制氨酰-tRNA 與 mRNA-核糖體復(fù)合物的結(jié)合，即防止任何進(jìn)入的氨酰基-tRNA 被信使 RNA 中的密碼子識別，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。

對四環(huán)素的抗性是通過以下幾種機(jī)制之一介導(dǎo)的：四環(huán)素流出、通過將特定細(xì)胞質(zhì)蛋白與核糖體結(jié)合來保護(hù)四環(huán)素結(jié)合位點(diǎn)、四環(huán)素修飾或在四環(huán)素結(jié)合位點(diǎn)處對 16S rRNA 進(jìn)行修飾。

 

圖 7. 四環(huán)素在核糖體位點(diǎn)結(jié)合并阻斷 tRNA 結(jié)合^[20]

 

 

相關(guān)產(chǎn)品

Puromycin dihydrochloride 一種氨基核苷類抗生素，抑制蛋白合成。

G-418 disulfate 一種氨基糖苷類抗生素，抑制真核生物和原核生物的蛋白質(zhì)合成。

Bekanamycin 一種氨基糖苷類抗生素，抑制一系列革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌。

Tetracycline 一種廣譜抗生素，對多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌有抑制活性。

Bleomycin hydrochloride 一種 DNA 損傷劑，抑制 DNA 合成；一種抗腫瘤抗生素。

Neomycin sulfate 一種氨基糖苷類抗生素，通過核 30S 核糖體亞單位的不可逆結(jié)合發(fā)揮抗菌活性，從而阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成；一種已知的磷脂酶 C (PLC) 抑制劑。

Gentamicin sulfate 一種氨基糖苷類抗生素，抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的生長并可抑制組織培養(yǎng)中的多種支原體菌株。

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