脂質(zhì)納米顆粒（LNP）在核酸藥物遞送中的應(yīng)用與相關(guān)技術(shù)發(fā)展

脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的主要作用是攜帶和傳遞遺傳信息。這兩類分子能夠用于疾病的預(yù)防、診斷和治療的，就是核酸藥物。核酸藥物包括反義核酸（ASO）、小干擾RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）、小激活RNA（saRNA）、信使RNA（mRNA）適配體（aptamer）、核酶(ribozyme)、抗體核酸偶聯(lián)藥物（ARC）等，是基因治療的一種形式。核酸藥物的最大優(yōu)點是可以簡單地通過重新排列A，G，C，T（U）的序列而成為新的藥物。核酸藥物能夠以化學(xué)藥物或抗體藥物無法靶向（例如mRNA和miRNA）的分子作為作用靶點，有望對傳統(tǒng)藥物療效不佳的疾病產(chǎn)生突破性的進展，比如難以治療的遺傳疾病、癌癥以及某些病毒感染（例如SARS-CoV-2）。近期FDA宣布新指南鼓勵基因治療（包括核酸藥物）創(chuàng)新。諾華、默沙東、輝瑞制藥、藥明康德等多家藥企在該領(lǐng)域進行了重要的布局。

由于新冠，mRNA疫苗、核酸藥物等獲得了更多的關(guān)注。現(xiàn)在mRNA疫苗、核酸藥物多是采用脂質(zhì)納米顆粒（LNP）來實現(xiàn)對mRNA等核酸分子的遞送的，輝瑞、Moderna等上市的mRNA新冠疫苗以及最早的RNA類藥物onpattro都是采用了脂質(zhì)納米顆粒來遞送各自的核酸藥物。本文綜述了脂質(zhì)納米顆粒在核酸藥物遞送的作用，組成，關(guān)鍵輔料，制備工藝，專利等方面。

1.核酸藥物傳遞系統(tǒng)是關(guān)鍵

核酸藥物的開發(fā)主要面臨三大問題：

1.1.核酸分子在體內(nèi)不穩(wěn)定性；

1.2.核酸分子潛在的副作用；

1.3.核酸藥物遞送系統(tǒng)開發(fā)難度大。

這其中最重要的是遞送系統(tǒng)的研發(fā)。核酸藥物在其注射進入人體后，如何存留足夠時間以準(zhǔn)確靶向到病變部位，同時避免損傷正常細胞，必須是研發(fā)出高效安全的藥物遞送系統(tǒng)，以解決核酸藥物遞送、穩(wěn)定性、脫靶效應(yīng)等難題。遞送系統(tǒng)可分為病毒載體和非病毒載體，病毒載體在基因治療中應(yīng)用較多，但由于其免疫原性、致瘤性、和有限的載藥量（loading capacity）使得其在核酸藥物中應(yīng)用相對較少；而非病毒載體應(yīng)用相對更多，如聚合物類（polymer）、脂質(zhì)類（liposome或LNP）；且可以將核酸藥物與特定的配體結(jié)合使其能夠靶向特定的細胞，如GalNAc、多肽、抗體等。LNP是目前核酸藥物研究應(yīng)用最多的遞送系統(tǒng)之一，LNP能夠安全而有效地遞送核酸。目前已經(jīng)有使用LNP的核酸藥物獲批，例如Alnylam公司獲批的全球第一個siRNA藥物Onpattro。LNP是目前比較成熟的一個技術(shù)平臺，用來遞送RNA藥物、疫苗或基因編輯工具。相對其他類型的核酸藥物遞送系統(tǒng)而言，LNP具有很多優(yōu)勢，比如核酸包封率高并且能夠有效轉(zhuǎn)染細胞，組織穿透性強，細胞毒性和免疫原性低，更有利于遞送藥物等優(yōu)勢，這些優(yōu)勢使LNP成為出色的核酸遞送系統(tǒng)。

2.核酸遞送脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的組成

有一些公司在核酸遞送系統(tǒng)的脂質(zhì)配比上是非常相似的，LNP的處方中可離子化陽離子脂質(zhì)占50%，剩下10%是中性脂質(zhì)，38-40%是膽固醇。脂質(zhì)納米顆粒（LNP）模擬細胞膜形成細胞，直徑只有100納米左右，成分包括中性脂質(zhì)、陽離子脂質(zhì)、膽固醇、PEG-脂質(zhì)。核酸藥物與普通化學(xué)藥物的明顯區(qū)別是核酸有數(shù)量龐大的磷酸根，因而呈負電，使用可離子化陽離子脂質(zhì)的LNP可以更好的包裹核酸藥物。陽離子脂質(zhì)有一個帶銨根的親水端，在酸性下與氫離子結(jié)合呈正電，借助兩者的靜電吸附，就能夠?qū)⒑怂岚�裹在脂質(zhì)納米粒中。當(dāng)LNP被細胞內(nèi)吞后，可離子化陽離子脂質(zhì)會在酸性環(huán)境下離子化，破壞內(nèi)涵體膜，從而實現(xiàn)LNP的內(nèi)涵體逃逸。LNP還可以設(shè)計成特異性結(jié)合載脂蛋白如APOE3，APOE3會將LNP帶到肝臟，LNP和肝細胞表面受體結(jié)合后通過細胞內(nèi)吞作用釋放藥物，起到靶向肝細胞的目的，包裹后的LNP外殼因陽離子脂質(zhì)的疏水端向外而呈疏水性，此時可以加入傳統(tǒng)脂質(zhì)體合成中常用的一端修飾有PEG的脂質(zhì)——PEG-脂質(zhì)，使PEG-脂質(zhì)的疏水端與陽離子脂質(zhì)的疏水端結(jié)合，而PEG-脂質(zhì)的親水端（連有PEG）則向外形成核酸脂質(zhì)納米粒的外殼。為了增加核酸脂質(zhì)納米粒的穩(wěn)定性，還可以添加適量的膽固醇等成分，使PEG-脂質(zhì)的疏水端與陽離子脂質(zhì)的疏水端結(jié)合更為緊密，最終得到核酸脂質(zhì)納米粒的成品。

3.核酸遞送脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的關(guān)鍵輔料

核酸遞送脂質(zhì)納米顆粒一般由以下輔料組成：

3.1.陽離子脂質(zhì)：與帶負電的 mRNA 結(jié)合，可高效包載核酸藥物，同時提供正電荷，與帶負電荷的mRNA復(fù)合，有助于內(nèi)涵體逃逸，mRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染，可離子化脂質(zhì)具有pH敏感性。具體產(chǎn)品有DOTAP,Cl，DLin-MC3-DMA，DC-CHOL等。

3.2.膽固醇：穩(wěn)定LNP結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)膜流動性，提高粒子穩(wěn)定性。

3.3.輔助型脂質(zhì)：常用DOPE，穩(wěn)定粒子，破壞內(nèi)涵體穩(wěn)定性，提高核酸遞送效率。

3.4.聚乙二醇化磷脂：提高粒子穩(wěn)定性，減少粒子在體內(nèi)與血漿蛋白的結(jié)合，延長體循環(huán)時間。例如DMG-PEG2000，DSPE-MPEG2000（藥用注射級）等。

3.5.穩(wěn)定劑蔗糖或海藻糖，提高LNP和mRNA疫苗的穩(wěn)定性，防止脂質(zhì)黏性過大。

4. 核酸遞送脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的氮磷比計算

在核酸脂質(zhì)納米顆粒合成時，正電荷與負電荷的數(shù)量比將影響到納米粒子的穩(wěn)定性、電位等性能。正電荷通常為具有可電離銨根（N）的陽離子脂質(zhì)，而負電荷則為帶有大量磷酸根（P）的核酸分子，兩者可通過靜電吸附的方式結(jié)合在一起。兩者不合理的比例可能會導(dǎo)致粒徑過大、穩(wěn)定性差等缺陷，正確計算正電荷與負電荷的比（N/P比）是非常重要的。在實際應(yīng)用中，也可以先定下N/P比，再確定有機相或水相的濃度，此時只需要逆向計算即可。

5. 核酸遞送脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的制備

目前常用的脂質(zhì)納米顆粒制備方法主要有薄膜水化法、擠出法、均質(zhì)法等。有報道采用微流控混合技術(shù)來制備核酸脂質(zhì)納米顆粒，該方法相對簡便快速，條件溫和，同時容易實現(xiàn)生產(chǎn)放大。通過不同生產(chǎn)規(guī)模的微流控機器，可以較好的實現(xiàn)mRNA-LNP的良好制備，其結(jié)果一致性良好，粒徑結(jié)果合適，且具有極低的PDI值，證實其分散性較好，并且包封效果可達90%以上。通過微流控技術(shù)高效、可放大的制備核酸脂質(zhì)納米粒，每小時可生產(chǎn)20升。

微流控技術(shù)基本原理：將脂質(zhì)與核酸分別溶解在水相和有機相后，將兩相溶液注入制備系統(tǒng)的兩條入口通道，一端是RNA的水溶液，一端是脂質(zhì)的乙醇溶液，通過兩相的快速混合，完成核酸脂質(zhì)納米顆粒的合成。 改變流體注入速度和比率，可以控制脂質(zhì)納米顆粒的粒徑大小。

也有文獻報道采用類似于微流控技術(shù)的沖擊式射流混合法可以實現(xiàn)大生產(chǎn)，利用 BlueShadow 80P 高壓泵，讓疫苗和脂質(zhì)溶液形成兩股射流，在腔體中進行對沖，利用流體動力學(xué)讓脂質(zhì)各個組分充分地混合，形成包裹mRNA的納米脂質(zhì)體顆粒。生產(chǎn)設(shè)備碰撞噴射混合器安裝在潔凈間（C級）內(nèi)，通過中控平臺控制工藝步驟中所有單元的流量。所有單元安裝在不銹鋼框架內(nèi)，以適應(yīng)藥品生產(chǎn)中的 CIP清潔程序。該系統(tǒng)包括：KNAUER 碰撞噴射混合器（IJM)， 脂質(zhì)/乙醇混合物和 mRNA/緩沖液混合物的入口管路，脂質(zhì)體出口管路，CIP在線清潔系統(tǒng)和不銹鋼框架。

6. 核酸遞送脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的專利

mRNA核酸技術(shù)起源于20多年前，主要來自UBC和UPenn。后面發(fā)現(xiàn)LNP可以很好的解決mRNA成藥性，所以針對LNP專利產(chǎn)生了很多的授權(quán)。在陽離子LNP的專利上，一般小核酸領(lǐng)域的企業(yè)的專利布局結(jié)構(gòu)為：由母案保護重要的脂質(zhì)制劑活性成分，分案保護脂質(zhì)制劑和治療性siRNA的組合，同時由于美國專利申請存在專利期限調(diào)整的制度，大廠會利用多重專利申請在一定程度上獲取不同的延長期限以延長專利對于產(chǎn)品的保護期。因此，在Arbutus前身Tekmira對于MC3脂質(zhì)體專利進行了詳盡保護的前提下，除非對于陽離子脂質(zhì)設(shè)計進行極大變革，很難突破陽離子脂質(zhì)體專利壁壘。但可以通過替換 LNP 中的其他脂質(zhì)，規(guī)避陽離子脂質(zhì)的專利壁壘，例如麗凡達生物用陰離子脂質(zhì)DOPS 替代了 輝瑞和 Moderna 處方中的中性脂質(zhì) DSPC。

目前國內(nèi)也發(fā)布了一種新型陽離子脂質(zhì)體專利CN201310099727.5，該專利包含陽離子脂質(zhì)體核酸類藥物制劑及其制備方法和用途。陽離子脂質(zhì)體處方主要包含陽離子脂質(zhì)，輔助磷脂，聚羧基甜菜堿脂質(zhì)分子和冷凍保護劑。該專利涉及的陽離子脂質(zhì)體克服了陽離子脂質(zhì)體毒性高，血液穩(wěn)定性差和轉(zhuǎn)染效率低的缺點，有效地提高了核酸類藥物的藥效，同時由于該制劑使用時不受血清干擾，因此簡化了實驗和治療中操作。

7.核酸遞送脂質(zhì)納米顆粒國內(nèi)發(fā)展的問題

對于核酸藥物，LNP與其他遞送系統(tǒng)相比，其包封效果、體內(nèi)外表達效果、體內(nèi)安全性等多方面都更具優(yōu)勢，可以說脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是最佳的遞送系統(tǒng)。國內(nèi)已有多家企業(yè)，例如瑞博生物，艾博生物，斯微生物，麗凡達生物， 圣諾生物等均投資研發(fā)核酸藥物脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)關(guān)鍵技術(shù)。據(jù)報道2020年廣州銳博生物技術(shù)有限公司投資1016萬元，建設(shè)核酸藥物脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)關(guān)鍵技術(shù)研究平臺，開展核酸藥物體內(nèi)遞送系統(tǒng)關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)。

但有三大難題依然制約國內(nèi)脂質(zhì)納米顆粒技術(shù)的發(fā)展：

1.輔料的缺乏，脂質(zhì)納米顆粒輔料的研發(fā)，輔料國產(chǎn)化；

2. 缺乏成熟的工業(yè)化生產(chǎn)設(shè)備；

3.缺乏既懂得制劑學(xué)和高分子材料學(xué)，又懂得制藥工程設(shè)備的人才；

如上所述，脂質(zhì)納米顆粒LNP作為非常有前景的核酸藥物載體，在制藥行業(yè)已備受關(guān)注。特別是現(xiàn)在，LNP是新冠mRNA疫苗的關(guān)鍵技術(shù)，在有效保護mRNA并將其運輸?shù)郊毎��?dāng)中發(fā)揮著舉足輕重的作用。同時LNP也應(yīng)用擴展到其他領(lǐng)域，比如醫(yī)學(xué)影像、化妝品、營養(yǎng)品、農(nóng)業(yè)以及納米反應(yīng)器等。隨著新輔料的發(fā)現(xiàn)，制備工藝的創(chuàng)新改進，LNP會表現(xiàn)出更復(fù)雜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和更優(yōu)秀的物理穩(wěn)定性，未來將會看到更多基于LNP遞送的核酸藥物上市，為腫瘤等多種疾病提供治療方案。

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