Digital Western Blot在領(lǐng)先靶向蛋白降解藥物公司研發(fā)中應(yīng)用

蛋白表達(dá)和功能異常調(diào)控可極大地改變細(xì)胞生理學(xué)并導(dǎo)致許多病理生理狀況如癌癥、炎癥性疾病和神經(jīng)退行性疾病等。內(nèi)源性蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)表達(dá)由從頭合成和降解速率的平衡來控制。靶向蛋白質(zhì)降解（Targeted Protein Degradation，TPD）以劑量和時(shí)間依賴性方式通過蛋白酶體對致病靶蛋白進(jìn)行降解。從目前藥物研發(fā)進(jìn)展來看，靶向蛋白降解的概念提供了革命性的藥物開發(fā)機(jī)會，預(yù)計(jì)將帶來現(xiàn)代小分子藥物研發(fā)的轉(zhuǎn)變。

在靶向蛋白降解領(lǐng)域，蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)（Western Blot，WB）是觀察細(xì)胞中濃度依賴性蛋白質(zhì)降解的經(jīng)典方法。然而，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)印跡非常耗費(fèi)資源，需要多個(gè)洗滌步驟和長孵育時(shí)間才能產(chǎn)生高質(zhì)量的印跡，導(dǎo)致技術(shù)操作復(fù)雜、通量低、定量不準(zhǔn)和重復(fù)性差等劣勢，難以推動選擇性誘導(dǎo)、快速和可持續(xù)性的蛋白質(zhì)降解療法的快速發(fā)展。

根據(jù)藥物研發(fā)需求，工業(yè)界迫切需要建立高效、靈敏、可量化和可重現(xiàn)的蛋白質(zhì)降解技術(shù)平臺，滿足不同通量和不同研發(fā)階段需求。目前全球領(lǐng)先的靶向蛋白質(zhì)降解藥物研發(fā)公司基本建立了高低通量結(jié)合、篩選和驗(yàn)證一體化的研發(fā)平臺。下面文章一窺行業(yè)領(lǐng)先的藥物公司平臺建設(shè)思路。
SLAS Discovery：C4 Tx團(tuán)隊(duì)總結(jié)加速靶向蛋白降解療法開發(fā)和優(yōu)化的高通量技術(shù)
本文總結(jié)了靶向蛋白降解領(lǐng)域最常采用的從低通量到高通量的幾種不同方法。詳細(xì)說明了傳統(tǒng)Western blot、基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的Digital Western Blot（ProteinSimple）、高通量流式細(xì)胞術(shù)（HTFC）、AlphaLISA SureFire技術(shù)、時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)技術(shù)和Nano-Glo HiBiT技術(shù)。
Digital Western Blot技術(shù)

Digital WB技術(shù)是傳統(tǒng)WB實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的高效替代方案。使用該技術(shù)，可在同一根毛細(xì)管中完成樣品分離、捕獲、固定、免疫檢測和定量分析，從而實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)WB的所有實(shí)驗(yàn)步驟（包括蛋白質(zhì)上樣、分離、免疫印跡、洗滌、檢測以及數(shù)據(jù)分析）自動化，有效提高蛋白質(zhì)表達(dá)定量結(jié)果的精確性和重復(fù)性。全自動Digital WB技術(shù)顯著地縮短了樣本檢測時(shí)間到3小時(shí)，直接采集化學(xué)發(fā)光或熒光信號值，利用數(shù)字化信號峰面積來表征蛋白含量，短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了目的蛋白的可視化精準(zhǔn)定量分析。ProteinSimple旗下具有系列的Digital WB系統(tǒng)，從25到96個(gè)樣本通量，可滿足靶向蛋白降解藥物研發(fā)過程中對中低通量檢測需求。

本技術(shù)可相對和絕對定量檢測目的蛋白豐度，適用于內(nèi)源性的或未修飾靶蛋白分析，如果抗體表位不受干擾，也可檢測修飾的標(biāo)記過的蛋白質(zhì)。與傳統(tǒng)WB相比，Digital WB可實(shí)現(xiàn)高分子量蛋白質(zhì)可靠捕獲和定量分析如BRD4案例。同時(shí)，需要樣本量少，只需要3 μL上樣量，特別適用于細(xì)胞或降解劑有限的條件下，96孔板中收集處理過的細(xì)胞可滿足檢測需求。除了自動化和標(biāo)準(zhǔn)化之外，批次數(shù)據(jù)差異CV值較低，重復(fù)性好。軟件符合21 CFR Part11，數(shù)據(jù)全程可記錄。這些優(yōu)勢使其成為工業(yè)領(lǐng)域蛋白表達(dá)檢測平臺的標(biāo)準(zhǔn)配置。
 

高通量流式細(xì)胞術(shù)（HTFC）和In-Cell Western (ICW)
流式細(xì)胞技術(shù)可分析細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)水平，技術(shù)進(jìn)步已使流式可作為中高通量篩選方法來輔助藥物發(fā)現(xiàn)。緊湊型流式細(xì)胞儀可檢測96孔板中細(xì)胞配體或蛋白質(zhì)的不同熒光強(qiáng)度。本質(zhì)上，高通量流式細(xì)胞術(shù)一次檢測單個(gè)細(xì)胞，提供單個(gè)細(xì)胞信號。而ICW對孔內(nèi)所有細(xì)胞進(jìn)行批量讀取。兩種方法使用比率熒光讀數(shù)來提高重現(xiàn)性和降低標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)而提高整體數(shù)據(jù)質(zhì)量。與傳統(tǒng)流式比，這兩種技術(shù)方案需要更少的樣本體積和檢測抗體可有效降低成本。但無法根據(jù)蛋白質(zhì)分子量參數(shù)來區(qū)分特異性和非特異性信號。
 

AlphaLISA SureFire技術(shù)

AlphaScreen是一種多功能的基于微珠相互靠近實(shí)驗(yàn)技術(shù)，基于生物分子的相互作用，可測定各種分析物包括標(biāo)記的或內(nèi)源性蛋白。本技術(shù)提高了檢測靈活性，微珠種類被設(shè)計(jì)識別各種不同的工程化蛋白質(zhì)標(biāo)簽，或AlphaLISA每個(gè)微珠能包被針對目標(biāo)蛋白不同表位的特異性抗體。當(dāng)與同一蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，Alpha供體和受體微珠會靠近，采用680nm近紅外光激發(fā)，供體微珠導(dǎo)致單線態(tài)氧分子釋放。單線態(tài)氧的產(chǎn)生本身不足以產(chǎn)生信號，但當(dāng)受體微珠靠近時(shí)，會引發(fā)能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生放大的熒光信號。AlphaLISA SureFire技術(shù)采用改進(jìn)光譜特性的微珠，只能進(jìn)行終點(diǎn)分析，需要細(xì)胞裂解來觀察感興趣蛋白質(zhì)信號。對于時(shí)效性降解曲線，可通過多個(gè)高通量篩選細(xì)胞培養(yǎng)板在不同時(shí)間點(diǎn)裂解來實(shí)現(xiàn)。該技術(shù)優(yōu)勢是有助于更快地優(yōu)化、自動化和小型化，適用于化合物常規(guī)和高通量篩選�？蓽p少實(shí)際操作時(shí)間和信號讀取需要的總時(shí)間，加速藥物發(fā)現(xiàn)。具有飛克級靈敏度和 4-5 log 寬動態(tài)范圍，使其適合于細(xì)胞內(nèi)、分泌或膜結(jié)合蛋白檢測。
 

對于靶向蛋白質(zhì)降解的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，384孔板可顯著縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。使用合適的抗體，通過使用針對靶蛋白翻譯后修飾的抗體來區(qū)分靶標(biāo)蛋白。例如使用特異性識別磷酸化蛋白的抗體直接評估具有自磷酸化活性激酶的化合物BiDAC抑制和降解影響，可與總蛋白（磷酸化和未磷酸化）測量值進(jìn)行比較。獲得這兩個(gè)數(shù)據(jù)可能會提高降解劑與抑制劑前體區(qū)分機(jī)制的理解，進(jìn)一步了解目標(biāo)蛋白調(diào)節(jié)對表型影響。

盡管有這些優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)有一些局限性。Alpha 微珠價(jià)格昂貴且對環(huán)境光高度敏感，需要在暗室環(huán)境添加實(shí)驗(yàn)試劑，上機(jī)前孵育期間盡可能避免在光線下長時(shí)間暴露。此外，讀板機(jī)溫度會影響單線態(tài)氧的生成和擴(kuò)散速率，每攝氏度可高達(dá)10%。為了最大限度地減少批次間差異，實(shí)驗(yàn)微孔板和讀板機(jī)應(yīng)保持在溫度良好可控環(huán)境中。最后需要注意過渡金屬可導(dǎo)致單線態(tài)氧猝滅效應(yīng)。

時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)實(shí)驗(yàn)

TR-FRET實(shí)驗(yàn)可用于檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平變化，有助于高效快速的靶向蛋白質(zhì)降解領(lǐng)域的藥物發(fā)現(xiàn)。與AlphaLISA SureFire 技術(shù)類似，TR-FRET 是一種直接的均質(zhì)混合和讀取夾心免疫分析方法，信號檢測前不需多次洗滌步驟。通過量化兩種熒光團(tuán)標(biāo)記的抗體之間的比率信號來確定蛋白降解水平，這些抗體結(jié)合同一蛋白質(zhì)上的兩個(gè)不同表位，采用供體和受體熒光團(tuán)標(biāo)記。
 

TR-FRET是終點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，需要細(xì)胞裂解來觀察檢測感興趣蛋白質(zhì)的信號。如蛋白降解動力學(xué)曲線，必須使用多個(gè)高通量篩選細(xì)胞板并行設(shè)計(jì)TR-FRET實(shí)驗(yàn)，以便裂解細(xì)胞并在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)后添加檢測抗體。將這些數(shù)據(jù)疊加可提供DC50、Emax偏移以及時(shí)效曲線。對于生物標(biāo)志物分析，重要的是兩種抗體使用不同表位與同一蛋白質(zhì)結(jié)合，以啟用 FRET 信號，同時(shí)將背景信號降至最低。與Alpha 技術(shù)一樣，該方法可用于測量目標(biāo)蛋白質(zhì)翻譯后的抑制，從而可對通路抑制以及總蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定量。也可區(qū)別癌癥樣本突變體和正常組織中相同蛋白質(zhì)野生型具有選擇性的降解劑。本技術(shù)需要購買高質(zhì)量特異性抗體，長期藥物發(fā)現(xiàn)工作時(shí)，TR-FRET 分析每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)成本可能是該技術(shù)的最大缺點(diǎn)，盡管成本可通過批量定制標(biāo)記抗體降低。TR-FRET實(shí)驗(yàn)的靈活性、適應(yīng)性和可轉(zhuǎn)移性具有優(yōu)勢。一旦針對某個(gè)細(xì)胞系靶蛋白的 HTRF方法建立，通常很容易轉(zhuǎn)移到表達(dá)相同蛋白質(zhì)的其他細(xì)胞系中。HTRF技術(shù)具有寬動態(tài)范圍和信號穩(wěn)定，而無需擔(dān)心環(huán)境光的猝滅效應(yīng)。

Nano-Glo HiBiT技術(shù)

Nano-Glo HiBiT技術(shù)是一種高通量靶向蛋白質(zhì)降解藥物篩選系統(tǒng)。本技術(shù)基于分成兩部分互補(bǔ)NanoLuc熒光素酶系統(tǒng)，11個(gè)氨基酸的HiBiT標(biāo)簽和 17.6 kD LgBiT多肽。采用 CRISPR基因編輯技術(shù)將11個(gè)氨基酸的 HiBiT標(biāo)簽引入到編碼目標(biāo)蛋白基因內(nèi)，或設(shè)計(jì)為可通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或慢病毒感染的重組DNA表達(dá)載體，兩種方式都可實(shí)現(xiàn)將標(biāo)簽與感興趣目的蛋白相連。加入特有的裂解檢測試劑，HiBiT會自發(fā)的與檢測試劑中與HiBiT互補(bǔ)的多肽LgBiT結(jié)合，二者結(jié)合后可形成有催化功能的NanoLuc 熒光素酶，可催化底物產(chǎn)生明亮的發(fā)光信號。該信號強(qiáng)度與細(xì)胞裂解物中的 HiBiT 標(biāo)記蛋白含量成正比。

本技術(shù)檢測蛋白質(zhì)濃度線性范圍有幾個(gè)數(shù)量級，產(chǎn)生的發(fā)光信號可穩(wěn)定數(shù)小時(shí)，因此適用于蛋白質(zhì)降解劑藥物發(fā)現(xiàn)階段的高通量篩選。將HiBiT標(biāo)簽基因編輯敲入到感興趣的蛋白質(zhì)序列中，并生成穩(wěn)定表達(dá) HiBiT 標(biāo)簽?zāi)康牡鞍椎募?xì)胞系，整個(gè)實(shí)驗(yàn)開發(fā)時(shí)間至少需要3-4周。如需要挑取高表達(dá)HiBiT信號的單細(xì)胞克隆，則這個(gè)系統(tǒng)開發(fā)時(shí)間額外增加2-3周。與不需要基因編輯開發(fā)表達(dá)HiBiT細(xì)胞系技術(shù)相比，開發(fā)時(shí)間長是這種方法的一個(gè)缺點(diǎn)。然而，一旦產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)的具有足夠信號的細(xì)胞克隆或細(xì)胞群，操作只需加樣、直接均勻混合和讀取檢測，比較簡單。

HiBiT 技術(shù)也可進(jìn)行實(shí)時(shí)動力學(xué)蛋白降解檢測。LgBiT蛋白通過慢病毒轉(zhuǎn)染到已經(jīng)表達(dá)HiBiT標(biāo)記的目標(biāo)蛋白細(xì)胞中，同時(shí)表達(dá)HiBiT和LgBiT標(biāo)簽，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中重組發(fā)光NanoBiT酶都存在，通過與特定底物作用來檢測信號隨時(shí)間變化值。作為單一的非裂解試劑添加步驟，持續(xù)幾分鐘到幾小時(shí)到幾天時(shí)間內(nèi)實(shí)時(shí)測量目的蛋白質(zhì)降解，所以這種方法檢測板和HiBiT試劑成本方面更具成本效益，但長時(shí)間實(shí)驗(yàn)需要配置自動化系統(tǒng)。
 

 

 

 

通過CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因座特異性敲入或慢病毒轉(zhuǎn)基因表達(dá)，靶蛋白表達(dá)為一種具有 FKBP12F36V 突變體的嵌合體。dTAG-13等 dTAG 化合物由一個(gè)高選擇FKBP12F36V 配體與 E3 連接酶配體連接組成，該配體在融合蛋白和 E3 連接酶之間形成一個(gè)三元復(fù)合體，從而引起靶蛋白多聚泛素化和降解，dTAG-13 已被用來檢測和驗(yàn)證癌癥新靶點(diǎn)。

下圖利用dTAG降解劑處理表達(dá)FKBP12F36V 融合蛋白，評估探索劑量依賴性降解反應(yīng)。利用Digital WB檢測蛋白降解水平，最高劑量500nM下觀察到最大降解。在這種情況下，與 5nM dTAG-13 處理相比，用相應(yīng)的陰性對照 (dTAG-13-NEG) 處理似乎略微降低了目標(biāo)蛋白水平。A圖CRBN募集dTAG降解劑dTAG-13，B圖是VHL募集的dTAG降解劑dTAGV-1。與 dTAG-13處理一樣，觀察到劑量依賴性降解，最高測試劑量 (500 nM) 下觀察到最大降解。右圖條帶圖和峰面積圖定量數(shù)據(jù)顯示兩個(gè)dTAG降解劑之間的靈敏度差異。與 dTAG-13相比，用dTAGV-1處理后的降解更敏感，在這種情況下，dTAGV-1將用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的首選降解劑。
 

采用dTAGV-1處理野生型FKBP12和FKBP12F36V 靶標(biāo)2細(xì)胞，Digital WB可直接反應(yīng)融合蛋白與野生型分子量變化，同時(shí)準(zhǔn)確檢測dTAGV-1劑量依賴性降解反應(yīng)。
 

通過以上案例，可知傳統(tǒng)免疫印跡方法重復(fù)性較差、定量不準(zhǔn)確和操作時(shí)間長等技術(shù)限制，很難滿足蛋白泛素化水平檢測和靶標(biāo)驗(yàn)證的精準(zhǔn)定量需求。Digital WB技術(shù)是基于毛細(xì)管電泳的快速定量免疫學(xué)檢測方法，可檢測靶蛋白和泛素化蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而準(zhǔn)確反應(yīng)靶向蛋白降解研究過程量效關(guān)系和時(shí)效關(guān)系。Digital WB技術(shù)可靈敏地、快速地、可重復(fù)性確認(rèn)內(nèi)源性蛋白降解，以確保與初步篩選實(shí)驗(yàn)中高通量技術(shù)獲得一致性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是RPOTAC技術(shù)平臺構(gòu)建的必備技術(shù)。已被GSK、Pfizer、Arvinas、Kymera therapeutics、C4 therapeutics，藥明康德和康龍化成等領(lǐng)先RPOTAC藥物研發(fā)和服務(wù)公司采用。

PROTAC 是 Arvinas, Inc. 的注冊商標(biāo)，BiDAC是C4 therapeutics的注冊商標(biāo)。其他商標(biāo)和注冊商標(biāo)是其各自所有者的財(cái)產(chǎn)，本文引自如下文獻(xiàn)：

1. Jeffrey R. Simard, Linda Lee etc. (2021). High-Throughput Quantitative Assay Technologies for Accelerating the Discovery and Optimization of Targeted Protein Degradation Therapeutics. SLAS Discovery. Vol. 26(4) 503–517

2. Ellen F. Vieux, Roman V. Agafonov etc. (2021). A Method for Determining the Kinetics of Small-Molecule-Induced Ubiquitination. SLAS Discovery. Vol. 26(4) 547–559