Fus基因敲除小鼠的表型介紹與應(yīng)用

賽業(yè)生物《每周一鼠》，每周更新，為大家講解一個(gè)小鼠模型的故事，希望對(duì)大家了解不同的小鼠模型有所幫助。今天和大家見(jiàn)面的是Fus基因敲除小鼠。

Fus基因
該基因編碼異質(zhì)核核糖核蛋白 （hnRNP） 復(fù)合物的多功能蛋白質(zhì)組分。hnRNP復(fù)合物參與pre-mRNA剪接和完全加工的mRNA向細(xì)胞質(zhì)的輸出。該蛋白屬于FET家族的RNA結(jié)合蛋白，其與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)、基因組完整性的維持和mRNA/microRNA加工有關(guān)。該基因缺陷會(huì)導(dǎo)致肌萎縮側(cè)索硬化。

人FUS基因是由15個(gè)外顯子編碼526個(gè)氨基酸的RNA結(jié)合蛋白，包含幾個(gè)不同的功能域，包括RNA識(shí)別基序和高度保守的C端核定位信號(hào) （NLS），許多已識(shí)別的突變發(fā)生在該區(qū)域。該結(jié)構(gòu)域與尤文氏肉瘤（EWS）蛋白和TATA結(jié)合蛋白相關(guān)因子15 （TAF15）共享，它們與FUS一起被稱為FET蛋白家族，最初被描述為人類惡性腫瘤中融合癌基因的一部分。[1]
 

圖1. FUS的結(jié)構(gòu)和功能域。[1]

Fus基因敲除小鼠表型
1  基因組維護(hù)和染色體穩(wěn)定性
Hicks等人使用基因捕獲載體隨機(jī)插入FUS基因第12號(hào)外顯子構(gòu)建Fus敲除小鼠。該等位基因產(chǎn)生了一個(gè)截?cái)嗟霓D(zhuǎn)錄本，western blot分析證實(shí)該等位基因表達(dá)了低水平的截?cái)嗟鞍�。然而，由于缺少核酸結(jié)合域，預(yù)計(jì)表達(dá)的產(chǎn)物不會(huì)保留活性。

Fus敲除的純合子小鼠不能哺乳，并在出生16小時(shí)內(nèi)死亡（表1）。新生的Fus敲除小鼠通常是同窩中最小的，但大小不超過(guò)正常變化。從胚胎期（E） 16日到出生，F(xiàn)us敲除胚胎的胸腺大小也減少，但總體胸腺結(jié)構(gòu)是正常的。此外，F(xiàn)us敲除小鼠發(fā)育正常，系列切片的組織學(xué)檢查證實(shí)所有主要器官和組織的結(jié)構(gòu)和發(fā)育正常。
 

表1. Fus敲除小鼠生存、死亡情況。[2]

從E14.5小鼠移植的原代成纖維細(xì)胞中制備的中期染色體分析顯示，超過(guò)67%的Fus-/-細(xì)胞染色體存在非整倍性。還經(jīng)常觀察到其他染色體畸變，包括染色體斷裂、著絲粒融合和染色體外遺傳成分（EEs）的存在。對(duì)原代B淋巴細(xì)胞觀測(cè)也得到了類似的結(jié)果。Fus在維持基因組穩(wěn)定性方面的作用表明，在人類癌癥中當(dāng)Fus基因易位時(shí)，可能有助于Fus的致癌潛力。
 

圖2. Fus-/-細(xì)胞中基因組不穩(wěn)定性的發(fā)生率高[2]

2  生殖
Kuroda等人使用基因捕獲載體隨機(jī)插入基因第8號(hào)外顯子產(chǎn)生Fus敲除小鼠.該等位基因不表達(dá)完整的Fus蛋白。在129svev的近交繁殖背景下，很少有純合敲除小鼠在斷奶時(shí)還存活，沒(méi)有小鼠能生長(zhǎng)到成年。但在部分遠(yuǎn)交背景下（129svev和CD1品系雜交），F(xiàn)us-/-小鼠的生存幾乎沒(méi)有受到損害。

Fus-/-小鼠與野生型的交配顯示雄性完全不育，雌性的生育能力降低。后者反映在產(chǎn)仔數(shù)方面大約是129svev;CD1背景產(chǎn)仔數(shù)的一半。不育雄性表現(xiàn)出正常的交配行為并產(chǎn)生交配栓。Fus-/-小鼠附屬性器官的大小與小鼠的整體大小是成比例地減小的。內(nèi)生殖器解剖結(jié)構(gòu)正常，精囊內(nèi)含有正常量的精液。這些解剖特征和Fus-/-小鼠的正常交配行為表明雄激素功能沒(méi)有受到突變的影響。
 

圖3. 9周齡的野生型和Fus-/-小鼠雄性的內(nèi)生殖器顯微照片。[3]

Fus-/-小鼠的睪丸只有正常大小的三分之二到一半，這是由精原上皮體積的選擇性減少引起的。對(duì)13只成年Fus-/-小鼠進(jìn)行組織學(xué)檢查：在3/13的Fus-/-小鼠中，精原細(xì)胞保存良好，是主要的細(xì)胞。其余10例中，大部分小管中存在精母細(xì)胞，但在上皮階段III-VIII出現(xiàn)粗線期細(xì)胞凋亡。因此，在上皮期 IX-XI小管中，細(xì)線期/合子期精母細(xì)胞比粗線期/雙線期精母細(xì)胞多得多。此外，在第XII期小管中觀察到了許多減數(shù)分裂過(guò)程中精母細(xì)胞死亡的例子。這些早期缺陷是局部的，偶爾會(huì)觀察到一些圓形的精子，甚至一些形狀異常的凝聚形式。該結(jié)果表明Fus-/-圓形精子細(xì)胞可能是二倍體。這些結(jié)果表明Fus的缺失導(dǎo)致了減數(shù)分裂過(guò)程中的重大缺陷。Leydig細(xì)胞比例的明顯增加可能是由于腎小管體積的減少，而不是這些細(xì)胞的數(shù)量或大小的真正增加。野生型和突變型小鼠的睪酮水平相當(dāng)，證明了這些Leydig細(xì)胞的功能正常。
 

圖4. Fus缺陷與精子發(fā)生缺陷有關(guān)。（ A ）野生型小鼠睪丸代表性切片的顯微照片。4和5中的箭頭指向退化的減數(shù)分裂前精母細(xì)胞，6和7中的箭頭指向Fus-/-睪丸中明顯較大的圓形精子。7中的星號(hào)指向變形的細(xì)長(zhǎng)精子。[3]

3  行為學(xué)
Kino等人為了最大限度地提高 Fus KO小鼠的存活率，使用Hicks等人建立的小鼠模型與ICR小鼠雜交，建立遠(yuǎn)交背景下的純合子小鼠。

Fus-/-小鼠即使在90周齡時(shí)，也沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的運(yùn)動(dòng)缺陷。與野生型小鼠相比，F(xiàn)us-/-小鼠脊髓中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶陽(yáng)性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量沒(méi)有減少。此外，F(xiàn)us-/-小鼠的肌肉組織學(xué)沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的萎縮表型。還測(cè)量了Fus-/-小鼠的震顫樣運(yùn)動(dòng)。與野生型小鼠相比，沒(méi)有檢測(cè)到Fus-/-小鼠的振幅有任何增加。因此，F(xiàn)us基因缺陷不足以在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥（ALS）或特發(fā)性震顫（ET）樣表型。Fus-/-小鼠沒(méi)有表現(xiàn)出ALS或ET樣癥狀。最簡(jiǎn)單的解釋是Fus功能的喪失不足以導(dǎo)致ALS或ET。
 

圖5. 遠(yuǎn)交Fus-/-小鼠表型。[4]

對(duì)Fus-/-小鼠進(jìn)行行為分析發(fā)現(xiàn)Fus缺失改變了小鼠的部分腦功能，而運(yùn)動(dòng)功能未明顯受損。Fus-/-小鼠表現(xiàn)出行為異常，即多動(dòng)和焦慮相關(guān)行為的減少。
 

圖6. 遠(yuǎn)交Fus-/-小鼠的行為分析。[4]

FUS基因突變已被確定為肌萎縮側(cè)索硬化 （ALS）、特發(fā)性震顫和罕見(jiàn)形式的額顳葉變性 （FTLD） 的致病或危險(xiǎn)因素。許多與ALS相關(guān)的突變位于FUS的C端核定位信號(hào)中，導(dǎo)致它位于細(xì)胞質(zhì)中而不是細(xì)胞核中（野生型 FUS 主要位于此處）。雖然與ALS相關(guān)的突變基本沒(méi)有“失活（Loss Function）”型的，但基因敲除小鼠仍然是我們研究這些基因功能和ALS深層機(jī)理的重要工具。
 

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參考文獻(xiàn)：
1. Nolan M, Talbot K, Ansorge O. Pathogenesis of FUS-associated ALS and FTD: insights from rodent models. Acta Neuropathol Commun. 2016 Sep 6;4（1）:99. doi: 10.1186/s40478-016-0358-8. PMID: 27600654; PMCID: PMC5011941.

2. Hicks GG, Singh N, Nashabi A, Mai S, Bozek G, Klewes L, Arapovic D, White EK, Koury MJ, Oltz EM, Van Kaer L, Ruley HE. Fus deficiency in mice results in defective B-lymphocyte development and activation, high levels of chromosomal instability and perinatal death. Nat Genet. 2000 Feb;24（2）:175-9. doi: 10.1038/72842. PMID: 10655065.

3. Kuroda M, Sok J, Webb L, Baechtold H, Urano F, Yin Y, Chung P, de Rooij DG, Akhmedov A, Ashley T, Ron D. Male sterility and enhanced radiation sensitivity in TLS（-/-） mice. EMBO J. 2000 Feb 1;19（3）:453-62. doi: 10.1093/emboj/19.3.453. PMID: 10654943; PMCID: PMC305582.

4. Kino Y, Washizu C, Kurosawa M, Yamada M, Miyazaki H, Akagi T, Hashikawa T, Doi H, Takumi T, Hicks GG, Hattori N, Shimogori T, Nukina N. FUS/TLS deficiency causes behavioral and pathological abnormalities distinct from amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol Commun. 2015 Apr 25;3:24. doi: 10.1186/s40478-015-0202-6. PMID: 25907258; PMCID: PMC4408580.

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