PCR反應(yīng)引物設(shè)計(jì)的六點(diǎn)原則和應(yīng)用實(shí)例

引物：存在有自然中生物的DNA復(fù)制引物(RNA引物)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)中人工合成的引物(通常為DNA引物)。一般所說(shuō)引物，指DNA引物。引物是 PCR反應(yīng)成功與否的關(guān)鍵，為了保證擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和效率，引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵循以下原則：

                    
一、引物設(shè)計(jì)：在 NCBI上搜索不同物種的相同基因，通過(guò)序列分析軟件得到相同基因的序列，即為該基因的保守區(qū)。

二、引物長(zhǎng)度：15-28 bp，大于38 bp時(shí)，退火溫度升高，不利于普通 Taq酶擴(kuò)增

三、引物中 GC的含量為40%-60%, Tm最接近72℃

四、由于密碼子的簡(jiǎn)并性，引物的3’端最好避開(kāi)密碼子的第三位(最好是 T)

五、堿基分布不均勻，3’端不超過(guò)3 G或 C

六、引物本身不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物設(shè)計(jì)完整，要通過(guò) BLAST驗(yàn)證。

PCR擴(kuò)增對(duì)模板要求不高，可以采用單鏈或雙鏈 DNA作為擴(kuò)增片段，但 PCR可以擴(kuò)增少量的 DNA，為保證擴(kuò)增的專(zhuān)一性，對(duì)不同來(lái)源的模板，起始濃度有一定要求，如下：

模版可以是純化過(guò)的樣品，也可以是粗制濫造的樣品，不同來(lái)源的模版采用不同的處理方法，試驗(yàn)?zāi)０婕兓�越�?jiǎn)單越好，但模版中若有 Taq酶抑制劑，蛋白酶，核酸酶等，會(huì)干擾反應(yīng)。取模時(shí)要注意保存，不要放置過(guò)久，避免反復(fù)凍融，防止降解。大多數(shù)人都會(huì)忽略這個(gè)問(wèn)題，當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不帶條紋時(shí)，可以?xún)?yōu)先考慮是否是模板降解的原因。

實(shí)例：細(xì)菌 DNA提取法
                             

1. 取1-2 ml菌液，離心12,000 rpm 10 min，除去上清，得到沉淀

2. 根據(jù)得到的沉淀量，加入約500 ul的 TE (以下是配方)懸浮沉淀，并加入20 ul溶菌酶，30 min 37度保溫

3. 加入10%的30 ul的 SDS和1 mg蛋白酶 K，混合后1 h 37度保溫

4. 5 mol/l氯化鈉的添加量為120 ul，完全混合，65度置10 min

5. 等體積的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)充分混合后，12000 rpm離心5 min，在干凈的 EP管中得到上清

6. 等體積氯仿：異戊醇(24:1)充分混合，12,000 rpm離心5 min，得到上清于速凝膠管

7. 加入等體積的異戊醇，充分混合，-20℃置入30 min,10000 rpm，離心5 min

8. 除去上清液，得到 DNA沉淀用70%乙醇漂洗(動(dòng)作輕柔，不產(chǎn)生沉淀)，吸干，通�？傻玫�3-5 ug DNA