DAP和Reuterin通過抑制異二聚化作用作為HIF-2α抑制劑

研究證明了土著細(xì)菌具有鐵依賴性機(jī)制，可以抑制宿主鐵的運(yùn)輸和儲(chǔ)存。通過微生物代謝物的高通量篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)，腸道菌群產(chǎn)生的代謝物能抑制腸道鐵吸收主要轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導(dǎo)因子 2α (HIF-2α)，并增加鐵存儲(chǔ)蛋白鐵蛋白 (Ferritin)，從而抑制宿主的鐵吸收。兩種菌群代謝物—— DAP 和 Reuterin，通過抑制異二聚化作用作為 HIF-2α 抑制劑，可以有效緩解全身鐵超負(fù)荷。研究提供了腸道菌群代謝串?dāng)_的證據(jù)，且其對(duì)于系統(tǒng)性鐵穩(wěn)態(tài)是必不可少的。
 

評(píng)估 C57BL/6J 無菌 (GF) 小鼠不同飲食鐵限制的血液學(xué)反應(yīng)，結(jié)果表明本地腸道微生物種群與寄主之間存在著對(duì)鐵的競(jìng)爭(zhēng)，在鐵限制條件下更為明顯。GF 小鼠和無特定病原體動(dòng)物 (SPF) 小鼠都發(fā)生了鐵依賴性肝臟鐵調(diào)素 (Hepcidin) 表達(dá)下調(diào)。用廣譜抗抗生素 Cocktail (Abx) 處理的 SPF 小鼠中，鐵調(diào)素的表達(dá)與對(duì)照組沒有顯著差異，因此，頂端轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 Dmt1 和 Dcytb 的 mRNA 水平是由 SPF 小鼠的飲食鐵缺乏引起的，此外，Dmt1 和 Dcytb 表達(dá)水平在缺鐵 GF 小鼠中劇增。在基礎(chǔ)鐵供應(yīng)條件下，GF 小鼠中 Dmt1 和 Dcytb 的表達(dá)水平也顯著高于對(duì)應(yīng)的 SPF 組。利用相同飲食 SPF 小鼠糞便懸濁液灌胃 GF 小鼠進(jìn)行常規(guī)化 (GF-conv) 發(fā)現(xiàn)，GF-conv 小鼠的 CBC 值顯著低于 GF 組 (缺鐵癥狀)，Dmt1 和 Dcytb mRNA 水平也顯著降低。Abx 處理也進(jìn)一步證實(shí)腸道菌群在 Dmt1 和 Dcytb 表達(dá)中的作用。一致的是，在鐵缺乏反應(yīng)中，GF 小鼠沒有表現(xiàn)出 HIF-2α 依賴性促炎介質(zhì)上調(diào)。用 abx 處理上皮細(xì)胞 Hif-2α 缺失的小鼠（Hif-2α^ΔIE mice）,Dmt1 和 Dcytb mRNA 表達(dá)水平不變，Hif-2α 不缺失的小鼠則上調(diào)。免疫組化分析，GF 十二指腸上皮細(xì)胞 HIF-2a 過表達(dá)與內(nèi)在 VHL 缺失結(jié)果一致�？傊�，腸道菌群可抑制小腸中基礎(chǔ) HIF-2α 的表達(dá)和活性。

 

利用人多瘤干細(xì)胞 (hPSCs) 產(chǎn)生人的腸道類器官 (HIOs)，將活性與滅活的非致病性共生大腸菌菌株分別顯微注射到 HIO 內(nèi)腔中，只有活性菌株組才能誘導(dǎo) HIF-2α 及 DMT1 和 DCYTB 的表達(dá)，表明腸道 HIF-2α 抑制的機(jī)制與氧氣水平無關(guān)。

十二指腸和糞便有機(jī)提取物抑制了細(xì)胞中被誘導(dǎo)的 HIF-2α 表達(dá)，糞便提取物對(duì) DFO (缺鐵誘導(dǎo)物) 誘導(dǎo)的 HIF-1α 表達(dá)沒有影響，證實(shí)了腸腔提取物對(duì) HIF-2α 有特殊作用。GF-conv 小鼠的腸道提取物下調(diào)了 DFO 介導(dǎo)的 HIF-2α 誘導(dǎo)，而 GF 小鼠腸道提取物不能，證明了 HIF-2α 抑制性化合物源于微生物。  經(jīng)篩選，建立腸道菌代謝物庫并且從中鑒定出三種代謝物： Butyrate ， Propionate 和 DAP，并在細(xì)胞中驗(yàn)證了這三種化合物在蛋白質(zhì)水平上抑制 HIF-2α 表達(dá)。通過三種化合物在腸道的代謝水平以及對(duì) HIF-2α 的抑制水平分析，綜合表明，內(nèi)源性細(xì)菌衍生的代謝產(chǎn)物高特異性地抑制 HIF-2α。
 
 

微生物代謝物對(duì) FTN 的表達(dá)至關(guān)重要

已知，破壞腸道鐵存儲(chǔ)蛋白 FTN 增加鐵吸收能力。在基礎(chǔ)鐵條件下，GF 十二指腸中 FTN 的表達(dá)明顯低于 SPF 十二指腸，在 35ppm 鐵飲食中，肝臟和脾臟中更為明顯。在抗生素處理的小鼠中，十二指腸、肝臟和脾臟中的 FTN 表達(dá)顯著降低。GF-conv 小鼠的十二指腸 FTN 表達(dá)迅速恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。Ftn mRNA 在十二指腸中的表達(dá)沒有顯著變化，排除了腸道菌群的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

在腸特異性 Hif-2α^ΔIE 小鼠中，Abx 降低十二指腸 FTN 蛋白的表達(dá)，表明腸道微生物群調(diào)控 FTN 不依賴于 HIF-2a。經(jīng)過 Abx 處理后，缺乏 NCOA4 (Ncoa4 ^-/-) 十二指腸的 FTN 下調(diào)水平與野生型對(duì)照相似,Abx 下調(diào) Tlr2,4^-/- 和 Myd88^-/- 小鼠的 FTN 表達(dá)水平，由此排除了主要的細(xì)菌感應(yīng)途徑。且代謝物 Butyrate ， Propionate 和 DAP 對(duì) FTN 調(diào)節(jié)沒有影響。

 

DAP 通過阻斷 HIF-2α 異二聚化抑制其活性

在體內(nèi)，DAP 抑制缺鐵和抗生素誘導(dǎo)的 HIF-2α 活性， Butyrate 和 Propionate 則不能。GF, GF-conv 和 SPF 小鼠糞便代謝物不影響細(xì)胞 Hif-2α  mRNA 水平。 Butyrate 和 Propionate 上調(diào)了細(xì)胞 Hif-2α  mRNA 水平，而 DAP 處理則沒有顯著作用，表明腸道菌群介導(dǎo)的 HIF-2α 抑制作用與 mRNA 的水平無關(guān)。

HIF-2α 5'UTR 帶有鐵反應(yīng)元件 (IRE)，使其翻譯容易受到鐵調(diào)節(jié)蛋白 (IRP) 介導(dǎo)的抑制。 Butyrate 、 Propionate 或 DAP 顯著上調(diào)了 HIF-2α-IRE 的活性，排除了其通過 IRE 機(jī)制作用。PT2385  (購于MedChemExpress) 是 HIF-2α 的抑制劑，通過與 PAS-B 結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合干擾 HIF-2α-ARNT 異二聚體的形成。DAP 同樣顯著地抑制了 HIF-2α-ARNT 相互作用，但是沒有 PT2385 抑制程度高。最終數(shù)據(jù)表明，細(xì)菌代謝產(chǎn)物能充當(dāng)抑制 HIF-2α 活性的內(nèi)源性配體。

 

圖 4. DAP 通過阻斷異二聚體抑制 HIF-2α 的體內(nèi)活性
 

限制鐵水平導(dǎo)致微生物代謝產(chǎn)物更有效地抑制 HIF-2α

通過糞便代謝物處理細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，鐵的缺乏選擇性地促進(jìn)了微生物生長(zhǎng)或代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，這些代謝物具有較高水平的 HIF-2α 抑制作用，但缺鐵小鼠的 DAP 濃度沒有變化。鐵缺乏反而降低了腸道 Butyrate 的濃度，并且沒有改變乙酸鹽和 Propionate 的水平。16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序分析結(jié)果表明，在十二指腸提取物和糞便中，乳桿菌是唯一一種由于鐵限制而相對(duì)豐度顯著增加的菌屬�？傊�，限制鐵水平可能有利于特定細(xì)菌種群的生長(zhǎng)，產(chǎn)生腸道對(duì)抑制 HIF-2α 的代謝產(chǎn)物。

圖 5. 低鐵飲食可增強(qiáng)微生物代謝產(chǎn)物對(duì) HIF-2α 的抑制作用
 

Reuterin 是由羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生，在 GF 腸道中未被檢測(cè)出，但在常規(guī)化后顯著增加，Abx 的處理也顯著降低了腸道中 Reuterin 的濃度。Reuterin 致使 HIF-2α 在人腸上皮細(xì)胞系中的表達(dá)和活性呈劑量依賴性下調(diào)，與 DAP 相似 Reuterin 顯著破壞了 HIF-2α-ARNT 相互作用，PT 結(jié)合位點(diǎn)的突變則發(fā)生完全逆轉(zhuǎn)。

圖 6. Reuterin 通過阻斷異源二聚化抑制 HIF-2α 活性
 

益生菌或抗生素改善小鼠模型中鐵相關(guān)疾病

肝臟鐵調(diào)素基因敲除小鼠 (HAMP^ΔLiv mice) 中鐵發(fā)生過剩，用 DAP 處理導(dǎo)致胰腺和心臟的鐵顯著減少，但對(duì)肝臟不起作用。用 DAP 或羅伊氏乳桿菌處理 HAMP^ΔLiv 小鼠，能消除 HIF-2α 依賴性腸鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (DMT1，Dcytb 和 FPN) 的劇增。在小腸中，通過 Abx 干預(yù) Reuterin 和 DAP 的水平，以抑制共生和/或抑制 HIF-2α 的代謝產(chǎn)物以改善貧血。綜上所述，基于微生物組的療法可用于治療鐵相關(guān)疾病。

原文鏈接：Das NK， et al. Microbial Metabolite Signaling Is Required
for Systemic Iron Homeostasis.Cell Metab. 2019 Nov 1. 
 
相關(guān)產(chǎn)品：
PT2385
PT-2385 是選擇性的 HIF-2α 抑制劑，K_i 值小于 50 nM。