ANT 轉(zhuǎn)位酶抑制線粒體自噬成分鑒定方法

多維度的 CRISPR-Cas9 基因篩選

圖 1. 多維分析顯示線粒體自噬需要 ANT
 

ANT 促進細胞吞噬不依賴于ADP / ATP交換活性

ANT 位于線粒體內(nèi)膜上，介導 ADP 和 ATP 的跨膜交換，向線粒體 ATPase 提供 ADP 。藥理性抑制 ADP / ATP 的交換作用加劇了線粒體自噬。然而，盡管 Ant1 或Ant2 基因的缺失加劇 CCCP 誘導的膜極化，卻反常地抑制了線粒體自噬，因此，ANT 是通過其他機制抑制了線粒體自噬。ADP/ATP 交換相關(guān)突變 Ant1 (K43E/R244E) 能有效挽救線粒體自噬，保留 ADP/ATP 交換的疾病突變體 Ant1 (A90D),ANT1 (A123D) 不起作用。因此，ANT 促進線粒體自噬不依賴于ADP/ATP 交換活性。

ANT 的缺失抑制 PINK1 依賴的氧化應(yīng)激以及氧化磷酸化毒性引起的線粒體自噬，表明 ANT 在 PINK1 的上游起作用。正常情況下，PINK1 會被胞質(zhì)蛋白酶體組成型降解。但當線粒體受損后，TIM23 介導的轉(zhuǎn)運被抑制，使 PINK1 逃逸降解，并將 Parkin 募集到線粒體。ANT1 或者 ANT2 缺失時，CCCP 不能誘導 PINK1 保持穩(wěn)態(tài)，而野生型、K43E/R244E 突變型的 ANT1 維持 PINK 的穩(wěn)態(tài)。相比之下，CCCP 觸發(fā)的 TIM23 介導的蛋白易位到基質(zhì)中的抑制和 Su9-DHFR 前體的裂解減弱，表明 ANT1 或 ANT2 是抑制 TIM23 所必需。此外，ANT1 和 ANT2，ANT1(K43E/R244E) 都能與 TIM23 的相互作用，且 ANT1 (K43E/R244E) 還能抑制 TIM23，但 ANT1(A90D) 和 ANT1(A123D) 均不能。綜上，ANT 通過與 TIM23 相互作用，抑制 TIM23 轉(zhuǎn)錄酶響應(yīng)生物能崩潰，與 TIM23 作為 ADP/ATP 交換載體的活性無關(guān)。

ANT 通過 TIM44 介導 TIM23 的抑制

TIM44 是 TIM23 復合物的基質(zhì)側(cè)組分，其控制多肽跨 TIM23 的轉(zhuǎn)運。TIM44 敲除結(jié)果表明 TIM44 可能介導 TIM23-ANT1 的相互作用。TIM44 的丟失使線粒體吞噬和 PINK1 積累都變鈍。ANT1 (G146E/K147D) 不能在缺少 ANT1 的細胞中挽救線粒體自噬，但致病突變體 ANT1（A90D）也破壞了與 TIM44 的相互作用。相反， TIM44 (K282D) 盡管保留了與 TIM23 自身結(jié)合的能力，但無法挽救缺少 TIM44 的細胞的線粒體自噬。綜上數(shù)據(jù)表明，ANT1 與 TIM23 介導的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)因子 TIM44 相互作用，而 ANT1 與 TIM44 的相互作用是 ANT1-TIM23 相互作用、抑制 TIM23 介導的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運以應(yīng)對生物能量崩潰和促進有絲分裂的必要條件。

Ant1 缺失小鼠 (Ant1^KO mice) 的大腦和心臟線粒體自噬減弱，無論在轉(zhuǎn)錄組水平相同或者更高的情況下，PINK1 和 Pakin 的積累都比控制組顯著減少。觀察發(fā)現(xiàn)，Ant1^KO 小鼠的骨骼肌發(fā)生線粒體自噬嚴重缺陷。輕度肌肉疾病導致喪失 ADP/ATP 交換能力的患者，能通過重新表達野生型 Ant1 或者是 K33Q 缺陷 Ant1 都能恢復線粒體自噬，然而重度疾病 ADP/ATP 交換正�；颊咧斜磉_ ANT1 (A90D) 仍不能恢復自噬，這與 Ant1^KO 小鼠線粒體和線粒體 DNA 的堆積結(jié)果一致。值得注意的是，核編碼的線粒體基因并未受到影響。缺乏 ANT1 引起了線粒體自噬功能喪失，在一名攜帶 ANT1 純合功能缺失突變患者的臨床癥狀以及線粒體觀察中得到驗證。

圖 3. 體內(nèi)線粒體自噬需要 ANT1

小 M 的思考：

研究者的這一發(fā)現(xiàn)確定了 ANT 作為健康和疾病中線粒體自噬的基本介導者，為致病突變導致的線粒體穩(wěn)態(tài)相關(guān)疾病的研究提供了新思路。