CELLINK肝組織模型試劑盒B使用方法與應(yīng)用實(shí)例

說(shuō)明
肝組織模型試劑盒提供了用于包封肝細(xì)胞和/或星狀細(xì)胞的最佳生物墨水，然后進(jìn)一步利用所提供的抗體通過(guò)免疫熒光或免疫組織化學(xué)進(jìn)行功能分析。

包含：
· GelXA LAMININK 111 Bioink-3 mL
· Ⅰ型膠原抗體*-100µL
· ABCC2抗體*-100µL
· CYP3A43抗體*-100µL
*宿主：兔，已驗(yàn)證物種反應(yīng)性：人

儲(chǔ)存
生物墨水應(yīng)該儲(chǔ)存在攝氏4到8度之間。生物墨水的保質(zhì)期是兩個(gè)月。包裝上注明了有效期。在儲(chǔ)存之前，確保墨盒蓋上蓋子，以防干燥。保持生物墨水不凍-將生物墨水放入冷凍室有可能損害其印刷適性。如果從紫外線防護(hù)墨盒轉(zhuǎn)印，請(qǐng)保持生物墨水不受光影響， 以避免在印刷前交聯(lián)。在黑暗模式下使用3D生物打印機(jī)。光引發(fā)劑對(duì)反復(fù)或長(zhǎng)時(shí)間暴露于熱敏感。

抗體到達(dá)后應(yīng)保存在-20°C。當(dāng)儲(chǔ)存在-20°C時(shí)，抗體的作用至少為12個(gè)月。注意，抗體是非常穩(wěn)定的，當(dāng)適當(dāng)儲(chǔ)存時(shí)，可以使用更長(zhǎng)的時(shí)間�？贵w在-20°C保存前不需要等分。由于抗體是在甘油中提供的，它們?cè)谕扑]的儲(chǔ)存溫度下不會(huì)凍結(jié)，因此不會(huì)暴露于冷凍/解凍循環(huán)中。
 
與細(xì)胞混合
建議將GelXA LAMININK 111預(yù)熱至37°C，然后再與細(xì)胞混合。我們建議將生物墨水與細(xì)胞混合之前將 GelXA LAMININK 111 加熱至 37°C。 我們建議將 bioink與高濃度細(xì)胞混合。您可以手動(dòng)混合細(xì)胞，也可以使用我們革命性的 CELLMIXER 進(jìn)行更大數(shù)量的混合。CELLMIXER 旨在簡(jiǎn)化胞混合過(guò)程，并使細(xì)胞活力增加的均勻懸浮液成為可能。有關(guān)更多詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱與細(xì)胞混合方案GelXA 系列。

生物打印組織模型
肝組織模型可以通過(guò)在所需生物墨水（GelXA  LAMININK  111）中逐層生物打印肝細(xì)胞和
/或星狀細(xì)胞來(lái)生成。如果用原代細(xì)胞進(jìn)行生物打印，有限的細(xì)胞數(shù)目將限制構(gòu)建體的大小。因此，10-50µL的結(jié)構(gòu)、液滴或圓盤(pán)足以用于藥物篩選目的。還可以生成更大的構(gòu)造，特別是當(dāng)需要單元格分層時(shí)。訪問(wèn)我們的網(wǎng)站下載生物打印肝組織模型的示例代碼。
 
交聯(lián)
GelXA層狀油墨111生物打印構(gòu)建物的交聯(lián)用BIO X上的光固化模塊和/或用含CaCl2的交聯(lián)溶液進(jìn)行。如果同時(shí)使用兩種交聯(lián)方法，則從光固化開(kāi)始。在光固化之前，建議將印版溫度降低到15°C。將印版放置在冰面上，使GelXA層印墨111短暫凝固。在交聯(lián)劑中30秒至5 分鐘溫育時(shí)間對(duì)于大多數(shù)結(jié)構(gòu)是足夠的。孵育后，除去交聯(lián)液，用含鈣和鎂的Hank's平衡鹽溶液(HBSS+/+)或基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌并加入所需的細(xì)胞培養(yǎng)基。
 
組織學(xué)分析
要獲得生物打印結(jié)構(gòu)的 5-8 µm 部分，請(qǐng)參閱CELLINK 網(wǎng)站上支持部分下的固定、嵌入和切片協(xié)議GelXA 系列。 然后按照免疫熒光染色協(xié)議GelXA 系列用抗體染色組織模型。 I型膠原蛋白、ABCC2 和CYP3A43抗體的稀釋度如下：
 
GelXA Bioink描述
基于GelXA的生物油墨提供了GelMA的生物特性，在更寬的溫度范圍（如室溫）下具有印刷適性。GelXA生物油墨具有雙重離子和光誘導(dǎo)交聯(lián)能力，以更好地調(diào)節(jié)細(xì)胞敏感性，并允許調(diào)節(jié)構(gòu)建體的機(jī)械特性，使其具 有更多的組織特異性。GelXA bioink系列在明視場(chǎng)和熒光觀察中提供最小的光學(xué)干擾，用于無(wú)損分析。在組織化學(xué)分析中，GelXA也將具胞和細(xì)有最小的背景效應(yīng)，允許集中研究細(xì)胞-細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用。

抗體描述
肝組織模型的直接功能分析可以通過(guò)免疫熒光或免疫組化的組織學(xué)分析進(jìn)行。肝組織模型試劑盒中包含的抗體用于肝細(xì)胞和星狀細(xì)胞在生物打印構(gòu)建體中的單一或共培養(yǎng)。I型膠原抗體是用來(lái)評(píng)估在纖維化誘導(dǎo)過(guò)程中星狀細(xì)胞產(chǎn)生I型膠原的情況。ABCC2抗體用于評(píng)價(jià)肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)體多藥耐藥蛋白2(MRP2),CYP3A43抗體用于分析細(xì)胞色素P450中負(fù)責(zé)藥物代謝的一種酶。
 
肝抗體數(shù)據(jù)
用包括初級(jí)抗體I型膠原、ABCC2和CYP3A43的免疫熒光分析的內(nèi)部數(shù)據(jù)證明了對(duì)不同肝細(xì)胞類型和來(lái)源的優(yōu)化使用。
 
圖1.實(shí)施例在用LX2和HepG2共培養(yǎng)7天的3D生物打印的GelXA層連接111中I型膠原的表達(dá)。合并圖像I型膠原表達(dá)（1:50稀釋度），綠色，細(xì)胞核用DAPI（1:50稀釋度）染色， 藍(lán)色。二抗：Alexa Fluor 488。放大倍數(shù)：10倍，刻度線：100µm。
 
圖 2. ABCC2 在 3D 生物打印 3D 生物打印 GelXA LAMININK 111 中的 ABCC2 表達(dá)示例，該 GelXA LAMININK 111 在共培養(yǎng) 7 天時(shí)裝載 LX2 和 HepG2。 ABCC2 (MRP2)抗體可用于染色肝細(xì)胞 HepG2 細(xì)胞系和原代肝細(xì)胞。 ABCC2 表達(dá)（1:200 稀釋）、綠色和用 DAPI（1:50 稀釋）染色的細(xì)胞核、藍(lán)色的合并圖像。 二抗：Alexa Fluor 488。放大倍數(shù)：10X，比例尺：100 µm。
 
圖3.作為肝組織模型的3D生物打印的原代肝細(xì)胞中CYP3A43表達(dá)的實(shí)例。CYP3A43抗體可用于原代肝細(xì)胞的團(tuán)簇和單細(xì)胞染色。合并圖像CYP3A43表達(dá)（1:10 00稀釋度）,綠色, 細(xì)胞核DAPI（1:50稀釋度）染色,藍(lán)色。二抗：Alexa Fluor 488。放大倍數(shù)：10倍，刻度線：100µm。