高通量篩選檢測方法-分子篇
分子水平的篩選更多的是檢測酶/受體功能的改變或探針/蛋白質(zhì)結(jié)合的抑制，或是檢測蛋白質(zhì)-配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)、動力學(xué)和親和度。
下面將介紹了熒光偏振、熒光共振能量轉(zhuǎn)移、酶聯(lián)免疫吸附、表面等離子共振和核磁共振技術(shù)幾種方法。
■ 熒光偏振
熒光偏振是一項在高通量篩選中應(yīng)用廣泛的技術(shù)，適合研究不同質(zhì)量分子之間的結(jié)合。熒光偏振通常與結(jié)合物質(zhì)的百分比成線性比例，由此定量地測定 IC50 值。其多應(yīng)用于蛋白-分子 (配體)、蛋白-蛋白相互作用，核酸雜交等方面，幾乎可以應(yīng)用于所有蛋白類型，包括 GPCR、核受體及酶等。
Ali Camara 團隊將熒光偏振技術(shù)應(yīng)用到高通量篩選中，對 FDA 上市化合物、天然產(chǎn)物等 9680 種活性化合物進行篩選，得到了第一個 HYPE 腺苷轉(zhuǎn)移酶的小分子調(diào)節(jié)劑。
圖 1. HYPE 腺苷轉(zhuǎn)移酶的小分子調(diào)節(jié)劑篩選[3]
目的蛋白的表達和純化 → 優(yōu)化分析系統(tǒng) → 高通量篩選 → 結(jié)果分析 → 二次篩選 → 發(fā)現(xiàn)了至少兩種有效的 HYPE 腺苷轉(zhuǎn)移酶活性調(diào)節(jié)劑
■ 熒光共振能量轉(zhuǎn)移
熒光共振能量轉(zhuǎn)移適用于檢測兩個蛋白質(zhì)之間親和力的變化，或因其結(jié)合構(gòu)象的變化引起的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用方式的改變。熒光共振能量轉(zhuǎn)移中來自熒光供體的能量通過偶極-偶極相互作用被受體吸收，而其中能量轉(zhuǎn)移的效率很大程度上取決于供體和受主之間的光譜重疊，以及它們之間的距離和相對方向。
Yoshitomo Shiroma 團隊通過構(gòu)建 DNA strand exchange fluorescence resonance energy transfer (DSE-FRET) 系統(tǒng)，對 NF-κB 特定亞型抑制劑進行篩選，從 32914 種化合物中，獲得了 RelA 特異性抑制劑。通過這種篩選方法，甚至能區(qū)分 NF-κB 的具體某個亞基。
a. 首先通過高通量篩選從32914種化合物中篩選出2個化合物，b. 同時通過虛擬篩選選出 41 個相近化合物. c. 最后用DSE-FRET對43種化合物進行復(fù)測， 獲得了 RelA 特異性抑制劑。
■ 酶聯(lián)免疫吸附
酶聯(lián)免疫吸附試驗是最常用的實驗方法之一，可檢測和定量如抗體、蛋白質(zhì)和激素等物質(zhì)。但該方法存在靈敏度低等缺點，可以通過減少樣品體積，增加控制和吞吐量等方法優(yōu)化。
氧化應(yīng)激已被證實參與許多病理生理過程，而抗氧化防御系統(tǒng)中的幾個關(guān)鍵酶，包括血紅素加氧酶1 (HO-1)、超氧化物歧化酶 (SOD) 和谷胱甘肽s -轉(zhuǎn)移酶(GST)等，主要受到Keap1和Nrf2調(diào)控，所以作用于 Keap1-Nrf2 的抑制劑被認為是治療慢性氧化和炎癥應(yīng)激的重要途徑。
Yan Wang 團隊建立了一種新的基于酶聯(lián)免疫吸附的方法，對 1500 種 FDA 批準上市化合物高通量篩選，獲得了三種對 Keap1-Nrf2 蛋白相互作用抑制效果較好的小分子。
圖 3. 評估化學(xué)物質(zhì)對 Keap1-Nrf2 相互作用的抑制作用[12]
Keap1 蛋白用 Avi 標(biāo)簽標(biāo)記，連接生物素。生物素化的 Keap1 通過生物素-鏈霉親和素相互作用與鏈霉親和素包被的板結(jié)合。Nrf2 添加到板上并被 Keap1 捕獲。
■ 其他方法
以上三種高通量篩選方法均利用熒光檢測，目前還有其他非熒光途徑的檢測方法，在實際應(yīng)用中，多種方法聯(lián)合使用。
例如，Carlos Alvarado 團隊就先后使用表面等離子共振和核磁共振技術(shù)兩種檢測方法，先從 189 個片段化合物庫中篩選出 19 個化合物，再經(jīng)過核磁共振二次篩選出 11 個對局灶黏附激酶的局灶黏附靶向域起作用的化合物。
其他方法還有聲霧電離-質(zhì)譜分析和閃爍接近分析法等。例如 Arseniy M. Belov 等人在 Acoustic Mist Ionization-Mass Spectrometry: A Comparison to Conventional High-Throughput Screening and Compound Profiling Platform 一文中向我們展示了聲霧電離-質(zhì)譜分析的應(yīng)用，開發(fā)了一個高通量能與之兼容的方法，用以檢測組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的抑制。
圖 4. 聲霧電離-質(zhì)譜分析聯(lián)用[9]
高通量篩選有許多可用的技術(shù)，在選擇檢測方法時，最重要的標(biāo)準是先對實驗進行構(gòu)思，再設(shè)計適當(dāng)?shù)暮Y選方法來檢測。例如，在尋找某種酶的抑制劑時，可通過更加直觀的分子水平的篩選方法。
兩期文章中列出的檢測方法雖已經(jīng)可以涵蓋目前發(fā)現(xiàn)中的大多數(shù)方法，但隨著我們對潛在疾病的生物學(xué)過程的理解的深入，需要不斷開發(fā)新的技術(shù)和分析方法來研究這些日益復(fù)雜的系統(tǒng)。
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參考文獻
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5. Yoshitomo Shiroma , Go Fujita , Takuya Yamamoto , Ryou-U Takahashi . Identification of a Selective RelA Inhibitor Based on DSE-FRET Screening Methods. Int J Mol Sci. 2020 Nov 30;21(23):9150.
6. Praveen Bandaru, Dafeng Chu Wujin Sun . A Microfabricated Sandwiching Assay for Nanoliter and High-Throughput Biomarker Screening. Small. 2019 Apr;15(15):e1900300.
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8. Carlos Alvarado. Development of a Fragment-Based Screening Assay for the Focal Adhesion Targeting Domain Using SPR and NMR. Molecules. 2019 Sep 14;24(18):3352.
9. Arseniy M Belov, Joseph Kozole, Mark F Bean, Carl A Machutta, Guofeng Zhang, Enoch N Gao, Luke Ghislain , Sammy S Datwani , Melanie Leveridge, Roland S Annan. Acoustic Mist Ionization-Mass Spectrometry: A Comparison to Conventional High-Throughput Screening and Compound Profiling Platforms. Anal Chem. 2020 Oct 20;92(20):13847-13854.
10. Shaogui Wu , Bailing Liu. Application of scintillation proximity assay in drug discovery. BioDrugs. 2005;19(6):383-92.
11. Mohammed A Kashem . A high-throughput scintillation proximity assay for sphingosine-1-phosphate lyase. Assay Drug Dev Technol. 2014 Jun;12(5):293-302.
12. Yan Wang, Chu-Ying Xiao, Huang-Quan Lin, et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for Keap1-Nrf2 interaction inhibitors identification. Redox Biol. 2020 Jul;34:101573.
