Vero細胞在生物反應(yīng)器中傳代擴增的培養(yǎng)方法及工藝流程

Vero細胞是基因工程常用細胞的一種，使用生物反應(yīng)器進行Vero細胞規(guī)�；瘮U增培養(yǎng)是基因制藥的關(guān)鍵工藝。

一、Vero一次傳代細胞培養(yǎng)
1. Vero細胞洗脫和收集：
購買回來的Vero細胞的一般采用懸浮培養(yǎng)的方式在培養(yǎng)瓶中進行接種培養(yǎng)。當細胞增殖到傳代數(shù)量時可用DPBS緩沖液進行洗滌，經(jīng)過兩次充分稀釋后再用從培養(yǎng)瓶中收集細胞。
2. 轉(zhuǎn)瓶擴增：
用于Vero細胞增殖的培養(yǎng)基的主要成分有：含胎牛血清、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、抗真菌抗生素等成分的DMEM。根據(jù)產(chǎn)物的不同所使用的微載體也不相同，由于Hillex®微載體具有陽離子胺改性微孔表面可以在不影響細胞收獲效率的情況下提高細胞吸引和附著性的特點，所以在Vero細胞改造中被廣泛使用。傳統(tǒng)Hillex® II微載體制備，需在121℃的去離子水中進行高壓滅菌30分鐘左右。細胞接種在微載體中的參考密度為18-19個細胞/載體。培養(yǎng)條件為恒溫37°C;培養(yǎng)箱內(nèi)二氧化碳濃度以5%左右為宜。

二、Vero二次傳代細胞培養(yǎng)
當細胞在轉(zhuǎn)瓶中的培養(yǎng)密度達到指定擴培值后，按實驗要求向轉(zhuǎn)瓶中添加一定量的DPBS進行微載體清洗，這個步驟需要注意的是不要講DPBS溶液直接倒在微載體上以防細胞脫附。清洗2-3次后，倒出清洗液，加入胰蛋白酶溶液消化10分鐘左右即可形成單細胞懸浮液。此時可以用來進行細胞計數(shù)、細胞存活率統(tǒng)計。當細胞密度和存活率達到指定標準值，即可轉(zhuǎn)入5L的微載體培養(yǎng)生物反應(yīng)器中進行進行二次傳代培養(yǎng)。微載體生物反應(yīng)器經(jīng)高壓滅菌后，加入培養(yǎng)基。在添加細胞之前，培養(yǎng)基的pH值參數(shù)為7.2左右，調(diào)至7.2，DO值的設(shè)定以空氣飽和度的30%左右為宜。轉(zhuǎn)速設(shè)置在60 rpm左右；細胞添加期間，攪拌速率需增加至70 rpm，加入細胞后恢復(fù)為60 rpm。在微載體培養(yǎng)過程中通過氣體控制及通氧量來控制DO值。

從培養(yǎng)第2天起需要每天向生物反應(yīng)器內(nèi)批量灌注培養(yǎng)基及營養(yǎng)液，以補充養(yǎng)分消耗。

每天從取樣口處取樣采集，通過細胞計數(shù)法來分析細胞密度。正常培養(yǎng)下，5天左右即可達到指定擴增值。當細胞密度達到收獲值時，即可轉(zhuǎn)入下一個階段的擴增生產(chǎn)。

三、Vero三次傳代細胞培養(yǎng)
通過取樣測定檢測，當細胞達到指定的收獲密度時，即可關(guān)閉攪拌器停止攪拌，使微載體沉降，此時吸取上層的培養(yǎng)液，緩慢加入DPBS緩沖液進行細胞清洗，收獲細胞。

三次細胞傳代可選用15L的大容量生物反應(yīng)器進行細胞擴增。擴增培養(yǎng)過程與二次傳代工藝流程相同，只是每個階段的DO值、pH值、攪拌槳轉(zhuǎn)速等參數(shù)設(shè)置會有不同，需要參考生物反應(yīng)器的標準作業(yè)相關(guān)規(guī)定進行操作。當細胞生長密度達到指定值時進入下一階段生產(chǎn)。

從以上步驟我們可以看出生物反應(yīng)器在進行抗體蛋白的生產(chǎn)、基因制藥和濃縮方面都具有著不可替代的作用。通過生物反應(yīng)器進行載體培養(yǎng)技術(shù)可實現(xiàn)疫苗產(chǎn)品的GMP規(guī)�；�生產(chǎn)需求。