一文攬盡：熒光定量PCR擴(kuò)增曲線哪個階段最重要
qPCR擴(kuò)增曲線一般分成四個階段：基線期、指數(shù)期、線性期和平臺期。那么每個階段PCR產(chǎn)物量的變化都有什么區(qū)別呢？哪個階段最重要呢？小編這就一一道來。
基線期
PCR起始時，剛開始前幾個循環(huán)的熒光信號還沒有發(fā)生變化，接近一條直線，將其稱之為基線，一般是3-15個循環(huán)。在基線期內(nèi)，擴(kuò)增的熒光信號被背景熒光信號所掩蓋，無法判斷PCR產(chǎn)物量的變化。
指數(shù)期
擴(kuò)增的熒光信號高于背景熒光信號，擴(kuò)增曲線起峰，開始進(jìn)入指數(shù)期。在指數(shù)期內(nèi)，每個循環(huán)積聚的產(chǎn)物準(zhǔn)確加倍（假定100%反應(yīng)效率）。該階段的PCR反應(yīng)具有高度特異性和精確度。因?yàn)樗性噭┚渥悖磻?yīng)的動力學(xué)推動反應(yīng)有利于擴(kuò)增子加倍，所以產(chǎn)物出現(xiàn)指數(shù)級擴(kuò)增。只有在這個階段，Cq值與初始模板量的對數(shù)之間存在線性關(guān)系，所以在此階段進(jìn)行定量分析最合適。
線性期（高變異性）
隨著PCR反應(yīng)體系各成分的消耗，其中的一種或者多種成分限制反應(yīng)，導(dǎo)致反應(yīng)開始減緩，并且每個循環(huán)的PCR產(chǎn)物不再加倍，該階段不再是指數(shù)級擴(kuò)增。
平臺期
反應(yīng)停止，不再產(chǎn)生更多產(chǎn)物，并且如果放置時間夠長，PCR產(chǎn)物將開始降解。因?yàn)槊總�樣品具有不同的反應(yīng)動力學(xué)，所以每支試管或每個反應(yīng)將在不同的時間點(diǎn)進(jìn)入平臺期，最終的產(chǎn)物含量也各不相同。
由于線性期和平臺期的擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR的產(chǎn)物量與初始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以也不能通過這兩個階段的PCR產(chǎn)物量計(jì)算出初始模板量。想要知道初始模板量的多少，還要依賴指數(shù)期的Cq值進(jìn)行計(jì)算。
▲ 圖1. qPCR 反應(yīng)的重要階段
如圖所示，標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增曲線是呈現(xiàn)S型的。曲線是否符合標(biāo)準(zhǔn)，不僅跟樣本起始量、qPCR體系配制、反應(yīng)程序等相關(guān)，更依賴于一套高品質(zhì)的實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)。對于實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)來說，高度檢測靈敏度、高度重復(fù)性和高度穩(wěn)定性，是每一臺qPCR儀的追求。
高性能的Azure Cielo™實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)完全符合以上要求，該系統(tǒng)來自美國Azure Biosystems公司，融合了高品質(zhì)的帕爾特溫度模塊和基于光纖傳輸?shù)墓鈱W(xué)檢測系統(tǒng)，為您的科學(xué)研究提供高精準(zhǔn)、高靈敏可靠結(jié)果。提供Azure Cielo-3通道和Azure Cielo-6通道，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活配置。
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▲ 圖2. Azure Cielo™ 實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)
高度的靈敏度
使用探針法，同時在Azure Cielo™實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)和其他品牌產(chǎn)品上檢測GAPDH基因，結(jié)果表明：A）Azure Cielo™實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)對單拷貝基因的檢出率更高。B）Azure Cielo™實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)的Cq平均值要低于2個Cq。
▲ 圖3. 單拷貝基因檢測對比(n=96)
高度的重復(fù)性
源于優(yōu)異的孔間均一性。105拷貝數(shù)GAPDH模板，GAPDH引物擴(kuò)增，96孔重復(fù)結(jié)果。Cq平均值=19.1，變異系數(shù)（Cv）=0.002。
▲ 圖4. 96孔重復(fù)擴(kuò)增曲線 A）線性圖 B）對數(shù)圖
高度的穩(wěn)定性
穩(wěn)定可靠的溫度模塊和光學(xué)系統(tǒng)，確保儀器連續(xù)運(yùn)行1000輪qPCR實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)依然穩(wěn)定可靠，重復(fù)性高度一致。對GAPDH進(jìn)行檢測并連續(xù)計(jì)算Cq值得出平均值和Cq值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。Cq值=22.4+0.01。
▲ 圖5. 長時間連續(xù)工作數(shù)據(jù)穩(wěn)定
