定量磷酸化蛋白質(zhì)組學揭示循環(huán)拉伸下肺細胞的排列和線粒體長度變化

循環(huán)拉伸是一種可以在貼壁細胞中研究的過程，這些細胞接種在柔性表面上，然后周期性地進行拉伸。這一過程創(chuàng)造了一個動態(tài)環(huán)境，模擬不斷收縮的器官，如肺、心臟和肌肉組織。多項研究表明，拉伸會激活信號通路。例如，拉伸的肌肉細胞會激活 Nox4 信號通路，并增強核蛋白導入。
 

磷酸化是細胞的一個重要方面。例如，表皮生長因子受體 (EGFR)（質(zhì)膜上的一種酪氨酸激酶受體）的體細胞突變會導致自身磷酸化和組成型激活，從而導致癌癥中細胞分裂。刺激誘導的信號改變背后的蛋白質(zhì)磷酸化的特性可能為細胞中生理事件的調(diào)節(jié)提供重要的見解。近年來，磷酸化蛋白質(zhì)組學定量分析的最新進展使研究人員能夠研究信號通路的異常調(diào)控。
 

肺癌是導致死亡的主要原因。大多數(shù)以前的研究都是基于傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法。然而，肺細胞在呼吸過程中會周期性地受到機械力的影響。因此，了解肺細胞中誘導的循環(huán)拉伸的潛在機制可能對肺癌治療很重要。

基于此，臺灣中央研究院與國立臺灣大學基因體與系統(tǒng)生物學的學位項目進行了相關(guān)研究，首先應用磷酸蛋白質(zhì)組學技術(shù)來分析人 A549 肺癌細胞和 IMR-90 肺成纖維細胞中拉伸誘導的磷酸蛋白質(zhì)組。此外，使用生物信息學工具和統(tǒng)計方法分析了不同的磷酸化蛋白質(zhì)組學狀態(tài)，從而揭示了拉伸誘導的生物功能。
 

在這項研究中，對兩個細胞系應用了短期（15、30 和 60 分鐘）和長期（24 小時）的拉伸。循環(huán)拉伸實驗采用 10% 的 CSA 變化和單軸拉伸方向。對收集的蛋白質(zhì)進行消化和加工，然后使用 TiO2 進行磷酸肽的富集，通過質(zhì)譜法分析磷酸肽。使用 MaxQuant 軟件對磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進行量化和鑒定。最后對拉伸誘導的基因組和磷酸化蛋白質(zhì)組差異表達基因/蛋白質(zhì)進行了功能富集。

圖1  循環(huán)拉伸誘導的磷酸化蛋白質(zhì)組學分析的實驗步驟和工作流程
 

一些磷酸位點在兩種細胞系中都表現(xiàn)出對拉伸的敏感性，例如 SEPT9 Ser30 和 Zyxin Ser281。SEPT9 Ser30 的磷酸化促進了 HeLa 細胞中的細胞粘附。先前的研究表明，拉伸會破壞緊密的連接和粘附。SEPT9 Ser30 在 IMR-90 和 A549 細胞中均上調(diào)。因此，該實驗認為這種磷酸化有助于細胞對拉伸的反應。
 

同樣，磷酸化的 Zyxin Ser281 與 CDK8 相互作用，從而激活 YAP 介導的有絲分裂。該磷酸位點在兩種細胞系中均顯示下調(diào)。其他磷位點顯示出不同程度的改性。據(jù)報道，AKT1S1S Ser203 磷酸位點可激活 mTORC 信號通路，從而增強致癌性生長。該磷酸位點在 A549 癌細胞中上調(diào)，但在 IMR-90 成纖維細胞中下調(diào)。

在功能網(wǎng)絡(luò)分析中，發(fā)現(xiàn) A549 和 IMR-90 細胞均富集細胞骨架組織和細胞成分組織。為了深入了解循環(huán)拉伸誘導的生物學功能，應用了聚類分析發(fā)現(xiàn)，細胞-細胞粘附功能顯示兩種細胞系中六個簇的顯著富集。然后進一步研究了循環(huán)拉伸后是否會發(fā)生細胞運動，隨后觀察到循環(huán)拉伸后的細胞重排。在血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象。

細胞重排是由機械拉伸誘導的，這種拉伸經(jīng)常發(fā)生在各種細胞類型中，有趣的是，在研究中使用的 A549 和 IMR-90 細胞系中也觀察到了這種現(xiàn)象。細胞重新定向是對循環(huán)拉伸的常見反應，與此一致，在涉及絲狀聚合和合成的蛋白質(zhì)（包括肌動蛋白絲、肌球蛋白和微管）上發(fā)現(xiàn)了幾個顯著改變的磷酸位點。研究人員認為這些磷蛋白可能與循環(huán)拉伸誘導的細胞重排有關(guān)。

此外，實驗發(fā)現(xiàn)線粒體和高爾基體的轉(zhuǎn)運及其生物合成是功能富集的結(jié)果。結(jié)合拉伸誘導的基因表達和功能注釋，發(fā)現(xiàn)與線粒體組織相關(guān)的功能是通過循環(huán)拉伸調(diào)控的。該實驗數(shù)據(jù)表明，30 分鐘和 24 小時的拉伸可以延長線粒體長度，這可能與 IMR-90 和 A549 細胞的線粒體動力學有關(guān)。

圖2  循環(huán)拉伸作用下被顯著調(diào)控的必需蛋白中幾個磷酸位點可能參與的特定生物學功能。
 

A 微管相關(guān)蛋白1B（MAP1B）和谷氨酸受體相互作用蛋白1（GRIP1）之間的相互作用可以減慢線粒體運動。
B 肌球蛋白參與線粒體斷裂。
C 表皮生長因子受體 (EGFR) 信號的激活增強了肌球蛋白 IIA 的活性。
D 在兩種細胞系中，通過循環(huán)拉伸激活了幾種粘著斑相關(guān)蛋白。粘著斑活性的變化導致細胞重排。

在該研究中，磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)揭示了響應循環(huán)拉伸的細胞類型特異性和常見磷酸化位點。此外，證明了細胞重排是細胞抵抗持續(xù)拉伸的一種策略，并表明細胞拉伸可增加線粒體長度�？傊�，周期性循環(huán)拉伸引起的磷酸化水平變化可能為動態(tài)細胞拉伸提供新的視角。

參考文獻：Wang WH, Hsu CL, Huang HC, Juan HF. Quantitative Phosphoproteomics Reveals Cell Alignment and Mitochondrial Length Change under Cyclic Stretching in Lung Cells. Int J Mol Sci. 2020 Jun 7;21(11):4074. doi: 10.3390/ijms21114074. PMID: 32517296; PMCID: PMC7312583.
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