NIR-II近紅外二區(qū)熒光和光聲成像用于小分子熒光團(tuán)的受體工程

本文要點(diǎn)：第二近紅外窗口(NIR-II)熒光成像技術(shù)以其高靈敏度、高分辨率、可深入組織等特點(diǎn)，在體內(nèi)的各種應(yīng)用中成為一項(xiàng)新興技術(shù)。本文報(bào)道了一種以[1，2，5]噻二唑[3，4f]苯并三唑(TBZ)取代BBTD作為電子受體的NIR-II熒光分子的合理設(shè)計(jì)和合成。由于TBZ核的電子缺陷比BBTD弱，新制備的NIR-II分子基納米粒子在水中具有更高的質(zhì)量消光系數(shù)和量子產(chǎn)率。NIR-II BTB納米顆�？梢赃M(jìn)行視頻率熒光成像，用于小鼠耳朵、后肢和大腦的血管成像。此外，它在NIR-I區(qū)的巨大吸收率也促進(jìn)了使用光聲顯微鏡(PAM)和層析成像(PAT)的生物成像。在與Arg-Gly-Asp(RGD)肽表面偶聯(lián)后，功能化的納米顆粒確保了通過二維和三維圖像方式對整合素過表達(dá)的腫瘤進(jìn)行靶向檢測。因此，對有機(jī)熒光團(tuán)工程受體的研究提供了一種很有前途的分子設(shè)計(jì)策略，可以為多種生物醫(yī)學(xué)成像應(yīng)用提供新的NIR-II熒光。
 

 

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光聲成像(PAI)可以提供精確描述人體大小的三維圖像。NIR-II區(qū)域具有衰減的光散射和背景自發(fā)熒光，NIR-II成像在顯示深部解剖特征方面顯示出巨大的潛力，具有高靈敏度和清晰度，提供了傳統(tǒng)熒光成像技術(shù)不能很容易揭示的生物體內(nèi)的關(guān)鍵信息。NIR-II FLI和NIR-I PAI相結(jié)合的雙模式成像，發(fā)揮了各自的優(yōu)勢，彌補(bǔ)了各自的固有缺陷，提高了成像的準(zhǔn)確性，在有效的腫瘤診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。為了獲得NIR-II發(fā)射，一種強(qiáng)缺電子單元，苯并雙噻二唑(BBTD)，已被廣泛用作受體(圖1a)。由于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)效應(yīng)的存在，這些熒光團(tuán)通常在水相中存在低的量子產(chǎn)率(QYS)。發(fā)展了許多策略來增強(qiáng)QYS，包括染料與蛋白質(zhì)疏水結(jié)構(gòu)域的雜交，在分子結(jié)構(gòu)中引入屏蔽單元等。大多數(shù)報(bào)道的D-A-D結(jié)構(gòu)的NIR-II熒光團(tuán)的QYS仍然相對較低，因?yàn)樗鼈児逃械腎CT效應(yīng)。因此，探索新的受體單元對于為實(shí)際應(yīng)用提供更多可供選擇的NIR-II有機(jī)分子設(shè)計(jì)策略具有重要意義。
 

方案1 ：BBT的合成路線

 

考慮到電荷轉(zhuǎn)移能力的強(qiáng)度可以通過改變受主單元來調(diào)節(jié)，用相對較弱的受主取代BBTD是一種很有前途的抑制ICT效應(yīng)的方法，可以用增強(qiáng)的NIR-II熒光基團(tuán)的QY來抑制ICT效應(yīng)。本文以噻二唑苯并三唑?yàn)槭荏w，通過對受體單元的合理設(shè)計(jì)，合成了一種新型D-A-D結(jié)構(gòu)的近紅外熒光載體，苯并三唑(BTB)，并將其制備成納米粒子(BTB NPs)，用于雙近紅外光聲/近紅外II熒光成像。還利用RGD共軛的BTB納米粒子實(shí)現(xiàn)了靶向腫瘤成像。該研究為設(shè)計(jì)和合成用于高級生物醫(yī)學(xué)研究的新型NIR-II熒光載體打開了一扇新的大門。
 

圖2：(A)BTB NP示意圖(B)使用DLS測量水中BTB NPs的大小(C)BTB NPs的TEM圖像(D)BTB納米粒子(黑色)和BBT納米粒子(紅色)在水中的歸一化UV-VIS-NIR和PL光譜(E)積分熒光強(qiáng)度曲線圖(F)BTB在甲苯中、BTB納米粒子在水中和BBT在甲苯中的量子產(chǎn)率(G)BTB NPs在水中的PA光譜(62.5µg mL-1)，與純水形成對比(H)在730 nm激發(fā)時(shí)，PA信號(hào)強(qiáng)度隨BTB納米粒子濃度的變化(I)在730 nm激發(fā)下，雞胸組織中不同深度的BTB納米粒子(62.5µgmL-1)的PA信號(hào)

 

通過改進(jìn)的納米沉淀法(圖2a)制備了可水分散的納米粒子。先考察了BTB和BBT在甲苯中的吸收光譜和發(fā)射光譜，以及它們在水中的吸收和發(fā)射光譜，考察了受體單元對分子光學(xué)性質(zhì)的影響。首先這兩個(gè)分子的吸收光譜都顯示出兩個(gè)吸收帶：第一個(gè)吸收帶在30 0~5 0 0 nm范圍內(nèi)可歸屬于共軛骨架的π-π*和n-π*躍遷，第二個(gè)吸收帶在5 0 0~1 1 0 0 nm范圍內(nèi)，這表明這兩個(gè)分子在極性較弱的溶劑中表現(xiàn)出比在極性溶劑中更強(qiáng)的熒光。此外，與它們的甲苯溶液相比，這兩種納米粒子在水中的吸收光譜都發(fā)生了展寬和紅移，這歸因于納米粒子形成時(shí)的緊密分子堆積行為。其次，與BBT納米粒子相比，BTB納米粒子在730 nm處有藍(lán)移的吸收峰，但在水中的最大吸收處的消光系數(shù)約為2.4倍(BTB納米粒子在730 nm處的消光系數(shù)為19.6L g-1 cm-1，而BBT納米粒子在808 nm處的消光系數(shù)為8.2L g-1 cm-1)。第三，BTB納米粒子有很強(qiáng)的發(fā)射，峰值位于898nm，尾部密集延伸到1400 nm，而BBT納米粒子的發(fā)射光譜在相同條件下仍然無法檢測到(圖2d)。將BTB納米粒子封裝成納米粒子后，QY降至0.48%(圖2e-2f)，而BBT納米粒子由于熒光很弱，無法計(jì)算其量子效率。與BBT相比，BTB及其NPs的QY更高，這可以歸因于以TBZ為接受者的ICT效應(yīng)的降低�；�于以上觀察結(jié)果表明，BTB納米粒子適合于生物醫(yī)學(xué)成像，TBZ部分是構(gòu)建明亮的NIR-II熒光載體的一種有前途的候選材料。
 

圖3：(A)小鼠尾靜脈注射BTB NPs的示意圖(b-d)靜脈注射100g的BTB NPs后，小鼠后肢血管(B)、耳血管(C)和腦血管(D)的代表性近紅外-II熒光圖像(E)皮下注射BTB NPs用于淋巴成像的示意圖(F)注射BTB NPs的小鼠淋巴管和淋巴結(jié)的代表性NIR-II熒光圖像(G)經(jīng)尾靜脈注射BTB NPs的小鼠耳血管(H)和腦血管(I)的PAM成像中，沿紅線的橫截面熒光強(qiáng)度剖面(和高斯擬合)，以綠色圈出

 

為了評估BTB納米粒子在動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)成像中的潛力，我們分別使用定制的動(dòng)物熒光成像系統(tǒng)和PAM，通過NIR-II熒光和NIR-I PA技術(shù)在小鼠身上進(jìn)行了血管成像。對靜脈注射BTB NPs(1000LP)的C57BL/6J小鼠進(jìn)行了耳部、后肢和腦內(nèi)血管網(wǎng)的實(shí)時(shí)視頻速率NIR-II熒光成像。注射NP后10min(50g/只)，在功率密度為100mW cm-2的785 nm激發(fā)下，可清晰顯示后肢、耳和腦的血管構(gòu)筑(圖3a-d)。結(jié)果表明，后肢血管、耳血管和腦血管的熒光譜半高寬分別為76.0、71.6和110.3m，具有較高的靈敏度和良好的空間分辨率。此外，經(jīng)小鼠側(cè)腹皮下注射BTBNPs時(shí)，注射部位附近的淋巴結(jié)被點(diǎn)亮，顯示淋巴管的分辨率高，半高寬為454.0m(圖3e-g)。然后，使用PAM進(jìn)一步展示了BTB納米顆粒在體內(nèi)血管成像中提供的良好的空間和時(shí)間分辨率。將裸鼠麻醉后置于成像階段，然后對耳部和腦部的血管進(jìn)行成像。靜脈給藥時(shí)，在730 nm脈沖激光激發(fā)下，血管被點(diǎn)亮并清晰地觀察到(圖3h-i)。在PAM下測得耳血管的半高寬為223.0m，優(yōu)于文獻(xiàn)中在PAT下獲得的分辨率。16在去除頭皮的腦血管成像中，橫竇和上矢狀竇都能清楚地顯示出來(圖3I)。此外，大腦下靜脈也發(fā)出PA信號(hào)。
 

圖4：(A)在808 nm半導(dǎo)體激光器(140 mW cm-2)激發(fā)下，在143B荷瘤小鼠中使用BTB NPs超過72小時(shí)的代表性NIR-II FLI；(濾光片：1000 nm長通。箭頭表示皮下腫瘤(每組4例)比例尺：5 mm(B)基于BTB NPs的143B腫瘤顯像的T/NT比值超過72h(C)注射BTB(左，Video S1)或BTB-RGD NPs(右，Video S2)48h后，小鼠143B腫瘤光聲圖像(激發(fā)波長為730 nm)的三維體積再現(xiàn),比例尺=2 mm

 

為了提高成像探針在腫瘤部位的聚集，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)準(zhǔn)確診斷，將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)肽作為靶向配體修飾到BTB-NP表面，制備BTB-RGD納米粒。首先研究了共聚焦圖像，以證實(shí)BTB-RGD納米顆粒對腫瘤細(xì)胞的靶向能力。與40μg mL-1的BTBRGD納米顆粒單獨(dú)孵育后，癌細(xì)胞的熒光信號(hào)明顯高于無功能的BTB納米顆粒對照組。相比之下，正常3T3細(xì)胞與BTB-RGD納米顆粒孵育后的熒光強(qiáng)度與BTB-RGD納米顆粒孵育后的熒光強(qiáng)度無明顯差異。這些結(jié)果表明，RGD功能化納米探針的靶向性可以促進(jìn)αvβ3整合素高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對RGD48、49特異性結(jié)合的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)化。在裸鼠皮下接種143B骨肉瘤細(xì)胞和PC3前列腺癌細(xì)胞后，檢測了腫瘤的靶向性，結(jié)果表明，RGD功能化納米探針的靶向性可以促進(jìn)RGD48、49整合素高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對RGD48、49的靶向性。每種腫瘤分別用兩組荷瘤小鼠證實(shí)BTB-RGD納米粒(每組4只)的靶向性。如圖4a-b所示，荷瘤小鼠在注射BTB-RGD NP后48h，腫瘤部位的NIR-II熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，并達(dá)到最大值。然而，注射BTB NPs的小鼠腫瘤部位的信號(hào)在試驗(yàn)期內(nèi)只顯示出有限的增強(qiáng)。此外，注射BTB-RGD納米粒的小鼠腫瘤部位的熒光強(qiáng)度在各時(shí)間點(diǎn)均高于對照組。

 

量化分析表明在143B和PC3腫瘤模型中，BTB-RGD NP治療組小鼠的平均信號(hào)背景比(T/NT)分別為~14.2和8.1，而相應(yīng)的BTB-RGD NP治療組小鼠的平均信號(hào)背景比(T/NT)僅為5.0和4.9。對體外熒光成像結(jié)果的定量分析表明，注射BTB-RGD納米顆粒的小鼠的這些器官和組織都發(fā)出了不同信號(hào)強(qiáng)度的熒光。注射的BTB-RGD納米粒主要分布于腫瘤、肝臟、脾臟和淋巴結(jié)。皮膚樣本也顯示出熒光信號(hào)，表明btb-RGD納米粒由于與皮膚組織中表達(dá)的整合素αvβ3具有很高的結(jié)合親和力而被保留。除了熒光成像外，光聲斷層掃描(PAT)也被用來進(jìn)一步證實(shí)btb-RGD納米粒在腫瘤部位的整體靶向作用(圖4c)。這些結(jié)果成功地展示了BTB納米粒子在雙模式生物成像應(yīng)用中的巨大潛力。

 

一方面，利用NIR-II熒光成像的高靈敏度，成功地實(shí)現(xiàn)了腫瘤邊緣的二維清晰可視化。另一方面，雖然與熒光成像相比，PAT的時(shí)間分辨率和靈敏度相對較低，但它可以提供更好的空間分辨率和三維可視化。這有利于腫瘤組織體積圖像的重建，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。例如，醫(yī)生可以在三維上評估腫瘤組織的體積信息，并在單次注射造影劑后進(jìn)行熒光成像引導(dǎo)的腫瘤切除手術(shù)。因此，使用單一造影劑將這兩種成像方式結(jié)合起來，為精確的血管成像和癌癥治療提供了很好的機(jī)會(huì)。

 

參考文獻(xiàn)

Y. Li, H. Zhou, R. Bi, X. Li, M. Zha, Y. Yang, J. Ni, W. H. Liew, M. Olivo, K. Yao, J. Liu, H. Chen and K. Li, J. Mater. Chem. B, 2021, DOI: 10.1039/D1TB02282B.

 

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近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system 

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機(jī)，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴(kuò)展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀