血流擾動導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷的產(chǎn)生新機(jī)制及保護(hù)內(nèi)皮的小分子化合物

動脈粥樣硬化的病灶性質(zhì)表明局部血流動力學(xué)微環(huán)境在動脈粥樣硬化中的關(guān)鍵作用。在動脈分支和彎曲處具有低而往復(fù)的剪切應(yīng)力（振蕩剪切，OS）的擾動上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞 (EC) 中的促炎分子，從而誘導(dǎo)吸引循環(huán)單核細(xì)胞黏附、浸潤入動脈壁，平滑肌細(xì)胞活化、遷移至內(nèi)皮下，啟動動脈粥樣硬化發(fā)生。相比之下，在大動脈長直部具有高且單向剪切應(yīng)力（脈沖剪切，PS）的規(guī)則層流對血管系統(tǒng)具有抗炎和動脈粥樣硬化保護(hù)作用。

在出現(xiàn)任何功能性結(jié)果之前，ECs 中由擾流與層流引起的不同基因表達(dá)模式和表型就會出現(xiàn)，并且它們被認(rèn)為是動脈粥樣硬化或抗動脈粥樣硬化得內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志。系統(tǒng)地了解內(nèi)皮細(xì)胞致動脈粥樣硬化表型、基因表達(dá)和藥物作用之間的功能聯(lián)系，有助于有效地篩選抗動脈粥樣硬化藥物。

脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶-1/氧化還原因子-1（人類的 APEX1 和小鼠的 Apex1），能夠在 DNA 的無嘌呤/無嘧啶位點切割并激活許多轉(zhuǎn)錄因子的 DNA 結(jié)合活性，與血管 EC 功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。然而，APEX1 是否在內(nèi)皮表型的血流動力學(xué)調(diào)節(jié)中起作用仍有待確定�，F(xiàn)有證據(jù)表明，APEX1 在內(nèi)皮功能的調(diào)節(jié)中起著復(fù)雜的作用。盡管它很重要，但人們對 APEX1 在擾動流誘導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥和動脈粥樣硬化中的確切作用知之甚少。

基于此，北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院周菁課題組在《美國國家科學(xué)院院刊》發(fā)表了相關(guān)研究成果。通過使用基于 CMap 的計算系統(tǒng)生物學(xué)方法來搜索可產(chǎn)生與 PS 與 OS 誘導(dǎo)的基因特征相似的化合物，最終確定了牡荊素（vitexin），一種從山楂葉中分離的天然黃酮類化合物，它可以大大降低內(nèi)皮細(xì)胞的促炎反應(yīng)。該研究指出了脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶-1 (APEX1/Ref-1) 作為流體剪切力響應(yīng)分子在血流擾動誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及動脈粥樣硬化發(fā)生中具有重要作用。
 

人臍靜脈 ECs (HUVECs) 在四個時間段內(nèi)經(jīng)受 PS (12 ± 4 dyn/cm 2 , 1 Hz) 或 OS (0.5 ± 4 dyn/cm 2 , 1 Hz) （1、4、12 和 24 小時）。使用 CMap 數(shù)據(jù)庫分析剪切 24h 后細(xì)胞的測序數(shù)據(jù)，分析基因表達(dá)的相似程度，在 7056 個處理結(jié)果中尋找可以模擬 PS 與 OS 效應(yīng)的生物活性化合物。

首先，該研究通過使用具有 EC-特異性 Apex1 缺失和管腔內(nèi) APEX1 過表達(dá)的小鼠，支持內(nèi)皮細(xì)胞 Apex1 在血管內(nèi)皮功能的流量調(diào)節(jié)中發(fā)揮促動脈粥樣硬化作用而非抗動脈粥樣硬化作用的觀點。研究人員發(fā)現(xiàn) APEX1 在擾動流下具有促進(jìn)血管內(nèi)皮動脈粥樣硬化表型的作用。從機(jī)制上講，研究發(fā)現(xiàn) OS 誘導(dǎo)的促炎分子（SELE、VCAM1 和 ICAM1）的表達(dá)是由 APEX1 通過 NF-κB 通路介導(dǎo)的。這表明 APEX1 介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥和功能障礙是受干擾的血流刺激的動脈粥樣硬化性內(nèi)皮細(xì)胞中重要的病理生理特征和機(jī)制。

通過使用基于 CMap 的藥物篩選和表達(dá)譜，實驗證明了牡荊素對剪切敏感基因表達(dá)的影響。隨后的研究表明，牡荊素減輕內(nèi)皮細(xì)胞對 OS 和促炎細(xì)胞因子 TNF-α 的促炎反應(yīng)。此外，牡荊素的體內(nèi)給藥減弱了受擾流誘導(dǎo)的新內(nèi)膜形成和動脈粥樣硬化。有報道稱，牡荊素可抑制 ECs 中促炎細(xì)胞因子和 ROS 的產(chǎn)生，以及牡荊素在防止心肌功能障礙包括心肌肥厚、心肌梗塞和缺血/再灌注損傷中的應(yīng)用，但這些研究沒有確定牡荊素直接靶向的分子，也沒有確定其在內(nèi)皮細(xì)胞中的綜合機(jī)制途徑。因此該研究在報告牡荊素的抗動脈粥樣硬化作用方面是獨一無二的。

此外，研究結(jié)果通過利用靶標(biāo)參與測定 (CETSA) 結(jié)合生物物理表征 (SPR) 將牡荊素鑒定為 ECs 中 APEX1 的直接抑制劑。使用 CETSA，發(fā)現(xiàn)添加牡荊素可以穩(wěn)定 APEX1 的熱誘導(dǎo)聚集。應(yīng)用 SPR 測定法對牡荊素與 APEX1 的相互作用進(jìn)行動力學(xué)分析。SPR 方法還用于驗證已建立的 APEX1 抑制化合物 E3330 的作用，結(jié)果證明 E3330 與 APEX1 之間存在相互作用。藥理表征將牡荊素的內(nèi)皮保護(hù)活性與 APEX1 的促炎作用聯(lián)系起來，從而為牡荊素在動脈粥樣硬化抗炎治療中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

該研究的另一個主要發(fā)現(xiàn)是證明 OS 和 TNF-α 誘導(dǎo) APEX1 的核易位，這種誘導(dǎo)很可能是通過增強(qiáng)乙酰轉(zhuǎn)移酶 p300 與 APEX1 的結(jié)合而導(dǎo)致其乙�；�。

實驗表明，牡荊素可能會破壞 p300 和 APEX1 之間的關(guān)聯(lián)，以及隨后的乙�；�和核易位。值得注意的是，已經(jīng)在肺成纖維細(xì)胞和肺腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了乙�；� APEX1 的專屬核積聚。在腎細(xì)胞中，用組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素 A 處理導(dǎo)致 APEX1 的核易位至細(xì)胞質(zhì)。

盡管 ECs 中剪切應(yīng)力的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)仍未完全了解，但 p300 被證明是一種機(jī)械敏感蛋白，因為 ECs 中已顯示其磷酸化或乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的剪切調(diào)節(jié)變化。該研究通過表明 OS（與 PS 相比）提高 p300 磷酸化水平并促進(jìn)其與 ECs 中的 APEX1 的結(jié)合，解決了 p300 是否以及如何響應(yīng)不同剪切模式的問題。然而，OS 也有可能通過不依賴 p300 的途徑促進(jìn) APEX1 乙�；�，因為已經(jīng)發(fā)現(xiàn) APEX1 和 HDAC1 之間的直接相互作用。

總之，該結(jié)果表明，牡荊素對內(nèi)皮細(xì)胞 APEX1 的抑制是一種抗炎療法，其靶向受干擾的血流誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化 EC 表型和相關(guān)的動脈粥樣硬化形成。研究人員提出了一種機(jī)制，即擾動剪切應(yīng)力促進(jìn) p300 的磷酸化以誘導(dǎo)其與 APEX1 結(jié)合導(dǎo)致 APEX1 乙�；�，并且乙酰化的 APEX1 與 p50 和 p65 NF-κB 形成復(fù)合物，易位到細(xì)胞核中，并促進(jìn) NF -κB 信號激活促炎分子的表達(dá)。這種機(jī)制表明 APEX1 在通過血流動力學(xué)調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能/功能障礙方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

該實驗已經(jīng)證明了牡荊素對血管系統(tǒng)的抗炎作用，并將 APEX-1 確定為它在 EC 內(nèi)的直接靶向分子之一。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)牡荊素的多個潛在直接靶點和 APEX1 下游的功能通路，可能會提供有價值的藥理學(xué)認(rèn)識，并驗證牡荊素作為一種預(yù)防動脈硬化性心血管疾病的藥物。

參考文獻(xiàn)：Zhao CR, Yang FF, Cui Q, Wang D, Zhou Y, Li YS, Zhang YP, Tang RZ, Yao WJ, Wang X, Pang W, Zhao JN, Jiang ZT, Zhu JJ, Chien S, Zhou J. Vitexin inhibits APEX1 to counteract the flow-induced endothelial inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Nov 30;118(48):e2115158118. doi: 10.1073/pnas.2115158118. PMID: 34810252.

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