阿爾茲海默癥與Psen1基因編輯小鼠

“我覺得好像我的葉子都要掉光了，風(fēng)雨裹挾著我的枝葉，我...我再也沒有棲身之地了。”一聲令人心碎的獨(dú)白，來(lái)自電影《困在時(shí)間里的父親》阿爾茲海默癥老人安東尼迷失在時(shí)間里的最后一聲嘆息。

如果把人比作一棵樹，那么葉子就是回憶、情感以及生命力的象征。阿爾茲海默癥最可怕的地方在于它能秋風(fēng)掃落葉一般奪走患者的記憶、感知，甚至作為人的尊嚴(yán)。今天《每周一鼠》和大家見面的就是與阿爾茲海默癥相關(guān)的Psen1基因編輯小鼠。

Psen1基因
遺傳性的阿爾茲海默癥（AD）患者一般都攜帶突變的早老素蛋白（PSEN1，PSEN2）或淀粉樣前體蛋白（APP）。這些突變導(dǎo)致長(zhǎng)鏈的淀粉樣蛋白-β大量累積（AD患者腦中發(fā)現(xiàn)的淀粉樣蛋白沉積物中的主要成分）。

研究人員發(fā)現(xiàn)，Psen1可以通過(guò)影響γ-分泌酶（一種裂解APP的酶）進(jìn)而調(diào)控APP的加工。除此之外，Psen1可以通過(guò)直接調(diào)節(jié)γ-分泌酶活性或通過(guò)其自身酶活參與Notch信號(hào)通路中受體的裂解。目前，研究人員已經(jīng)鑒定出了該基因的多種可變剪接轉(zhuǎn)錄本，但只有部分轉(zhuǎn)錄本有確定的功能^[1]。
 

圖1. Psen1蛋白結(jié)構(gòu)^[2]。

阿爾茲海默癥
阿爾茲海默癥（AD）是一種常見于老年人的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理變化是大腦皮質(zhì)彌散性萎縮、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)細(xì)胞間大量老年斑形成等，進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶功能減退是其主要臨床癥狀。

老年期常見的癡呆有兩種，即阿爾茲海默癥（AD）和血管性癡呆：血管性癡呆是老年性癡呆的先兆，是腦血管疾病導(dǎo)致腦功能下降的結(jié)果；阿爾茲海默癥是一種進(jìn)行性、不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)退行性疾病，約占所有癡呆病例的60%-80%，如圖2^[3]。
 

 

圖2.老年癡呆的分類與比較^[3]_。

AD的病理學(xué)特征為腦部胞內(nèi)過(guò)磷酸化tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles, NFT）和胞外β-淀粉樣蛋白（amyloid β, Aβ）聚集形成的老年斑（senile plaques, SP）。

目前AD發(fā)病機(jī)制主流學(xué)說(shuō)——淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)認(rèn)為，是Aβ生成和清除的失衡導(dǎo)致AD的發(fā)生。PSEN1、PSEN2 和APP基因突變是通過(guò)影響APP加工剪切過(guò)程，使得Aβ的產(chǎn)量絕對(duì)增加或相對(duì)增加，觸發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而導(dǎo)致AD發(fā)生。淀粉樣蛋白假說(shuō)仍然是在臨床研究中描述AD的主要框架，并且繼續(xù)影響AD潛在治療的開發(fā)^[4]。
 

圖3. 淀粉樣蛋白假說(shuō)病理學(xué)變化^[3]。

《2019年世界老年癡呆癥報(bào)告》統(tǒng)計(jì)顯示全球每3秒鐘就有1例癡呆患者確診，其中2/3癡呆患者將發(fā)展成AD，到2050年全球患AD的人數(shù)將從4700萬(wàn)上升至1.31億。目前，我國(guó)每年平均有30萬(wàn)新發(fā)病例^[5]。

阿爾茲海默病的主流檢測(cè)方法包括：神經(jīng)影像學(xué)檢查、腦脊液CSF檢查、外周血抗體檢查及外泌體檢查，目前主要的診斷方式是聯(lián)合診斷^[3]。

Psen1基因編輯小鼠
1●Psen1基因敲除小鼠
Psen1基因敲除純合小鼠表現(xiàn)出骨骼畸形、Notch信號(hào)傳導(dǎo)減弱、神經(jīng)干細(xì)胞缺乏導(dǎo)致的腦生長(zhǎng)受損、腦出血、淀粉樣前體蛋白切割異常、出生前后死亡的現(xiàn)象^[6]。

2●Psen1點(diǎn)突變小鼠
之前的研究顯示，APP蛋白經(jīng)過(guò)β-分泌酶蛋白水解產(chǎn)生CTF-β，而CTF-β還是γ-分泌酶的底物。γ-分泌酶首先通過(guò)內(nèi)肽酶樣切割的方式（ε-切割）切割CTF-β，并產(chǎn)生長(zhǎng)鏈β-淀粉樣蛋白(Aβ)、Aβ₄₈和Aβ₄₉（圖4a）。隨后，γ-分泌酶通過(guò)羧肽酶樣的切割（γ-切割）來(lái)水解長(zhǎng)鏈Aβ，并產(chǎn)生更小長(zhǎng)度的Aβ。

研究顯示，家族性AD患者的Aβ肽發(fā)生了改變：在健康的人群中，Aβ₄₀（由40個(gè)氨基酸組成）占比較高，并且不會(huì)聚集。相比之下，類似Aβ₄₂和Aβ一樣較長(zhǎng)的Aβ在家族性AD患者的大腦中則表現(xiàn)出更高的致病性并且易于聚集^[7]。

研究人員的WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示全長(zhǎng)APP和CTF-β&α在Psen1-P436S雜合小鼠中并沒有改變（圖4b）。接下來(lái)，研究人員對(duì)Psen1-P436S雜合小鼠大腦中的Aβ40和Aβ42進(jìn)行了酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（ELISA）（圖4c-h）。在鹽酸胍(GuHCl)可溶性部分中，P436S雜合小鼠的Aβ₄₀減少而Aβ₄₂增加（圖4f-h），Aβ₄₂/Aβ₄₀的比率相較野生型小鼠增加了1.7倍。

在使用Tris-HCl緩沖鹽溶液時(shí)，相類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也得到了部分重現(xiàn)（圖4c-e）。這些結(jié)果表明，在小鼠體內(nèi)引入Psen1-P436S突變會(huì)改變γ-分泌酶的羧肽酶樣裂解（γ-裂解）活性。

但值得注意的是，研究人員在Psen1-P436S突變小鼠中未觀察到腦中淀粉樣蛋白沉積隨年齡增大而增加。雖然這樣結(jié)果與先前報(bào)道的Psen1突變敲入小鼠一致，但研究人員仍需要在研究阿爾茲海默病中注意到這些問題^[7]。
 

圖4. 通過(guò)BE和Target-AID兩種堿基編輯器產(chǎn)生的Psen1-P436S突變小鼠的表型分析。

a.γ-分泌酶對(duì)CTF-β的水解處理。CTF-β首先被內(nèi)肽酶樣裂解（ε-裂解），并產(chǎn)生Aβ₄₈和Aβ₄₉，以及APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(AICD)。隨后，γ-分泌酶通過(guò)羧肽酶樣裂解（γ-裂解）裂解Aβ₄₈和Aβ₄₉，生成更短的Aβ。

b.Psen1-P436S雜合小鼠腦中APP全長(zhǎng)(FL)蛋白和CTF蛋白的印跡分析。

c-h.Psen1-P436S雜合小鼠大腦的Aβ的ELISA檢測(cè)。將3個(gè)月大的雜合Psen1-P436S小鼠和同窩的野生型小鼠（每組n=4）的皮質(zhì)均質(zhì)化并使用Tris-HCl緩沖鹽溶液（TS）（c-e)和鹽刪除的內(nèi)容:分為酸胍緩沖液(GuHCl)(f-h)進(jìn)行溶解并對(duì)Aβ40和Aβ42進(jìn)行ELISA檢測(cè)。BE：Base Editor 3，TA：Target-AID。

治療方法
美國(guó)時(shí)間2021年6月7日，美國(guó)FDA宣布Aducanumab（商品名為Aduhelm）通過(guò)加速審批程序批準(zhǔn)上市，用于治療阿爾茲海默病患者/阿爾茨海默病人群中特定患者。這是2003年以來(lái)獲批的首個(gè)批注阿爾茲海默癥新藥；更重要的是，Aducanumab首次在臨床試驗(yàn)中顯示出了可能降低腦部β淀粉樣蛋白的療效，是首個(gè)針對(duì)阿爾茲海默癥潛在病理機(jī)制的新藥。但該藥在臨床試驗(yàn)中出現(xiàn)了關(guān)鍵臨床結(jié)論不一致的現(xiàn)象^[9]。

除此之外，2020年4月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了中國(guó)原創(chuàng)、國(guó)際首個(gè)靶向腦-腸軸的阿爾茲海默癥治療新藥（甘露特鈉膠囊、九期一、GV-971）。其作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)控紊亂的腸道菌群，治療大腦神經(jīng)炎癥，進(jìn)而緩解AD認(rèn)知功能障礙，除此之外，研究人員發(fā)還發(fā)現(xiàn)該藥GV-971能直接透過(guò)血腦屏障，通過(guò)多位點(diǎn)、多片段、多狀態(tài)地捕獲Aβ，抑制Aβ纖絲的形成，并使已形成的纖絲解聚為無(wú)毒單體^[9]。

除此之外，基于蛋白毒性的假說(shuō)，Arvanis公司利用其蛋白降解靶向嵌合體技術(shù)平臺(tái)（PROTACs）已經(jīng)開發(fā)出具有治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病潛力的化合物。臨床前結(jié)果顯示，PROTAC分子（外周給藥）可顯著降低小鼠大腦皮質(zhì)中致病Tau蛋白的水平^[10]。
 

圖5. PROTAC分子對(duì)小鼠模型中Tau蛋白的降解作用^[10]。

小結(jié)
對(duì)Psen1基因的研究非常火熱，因?yàn)樵摶�因是引發(fā)家族性阿爾茲海默癥的一個(gè)重要基因，同時(shí)，該基因突變的小鼠模型也非常多，有KI點(diǎn)突變小鼠模型以及直接點(diǎn)突變的小鼠，且兩種模型的表型類似。

不僅如此，研究人員還發(fā)現(xiàn)了在心腦血管中的Psen1基因cKO模型可能與心臟病發(fā)生形成有關(guān)，這一系列的研究結(jié)果都證明了該基因在體內(nèi)的重要作用。

除此之外，針對(duì)該基因或者該基因編輯模型的治療的相關(guān)研究也是十分火熱的。更值得一提，近幾年的創(chuàng)新藥以及許多處于管線中的基因治療手段，也為該基因的研究注入新動(dòng)力。