Tnni3k基因編輯小鼠在心血管疾病治療研究中的應(yīng)用

賽業(yè)生物《每周一鼠》，每周五更新，為大家講解一個(gè)小鼠模型的故事，希望對(duì)大家了解不同的小鼠模型有所幫助。今天和大家見面的是Tnni3k基因編輯小鼠。

Tnni3k基因
編碼835個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白，其蛋白分子量約為93kD。TNNI3K蛋白含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端為7個(gè)錨蛋白重復(fù)序列（ANK），中間近C端為典型的絲氨酸/蘇氨酸、酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，C末端是一富含絲氨酸的結(jié)構(gòu)域。TNNI3K屬于MAPKKK激酶家族，不僅可以發(fā)生自身磷酸化，而且可以將激酶通用底物髓鞘堿性蛋白磷酸化。

在胎兒6種組織、成人8種組織的Northern Blot檢測(cè)結(jié)果和76種組織的多組織點(diǎn)陣膜雜交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，TNNI3K僅在成人及胎兒的心臟中表達(dá)，而在其他組織中未見表達(dá)。因此，該基因是一個(gè)心臟特異性表達(dá)的激酶基因。不僅如此，該基因還能與心肌肌鈣蛋白I、心肌肌動(dòng)蛋白等一系列肌小節(jié)收縮調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生作用。心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C是調(diào)節(jié)TNNI3K的關(guān)鍵因子，另外，TNNI3K活性能被抗氧化蛋白1所抑制^[1,2]。
 

圖1. TNNI3K蛋白結(jié)構(gòu)。

Tnni3k與心血管疾病
與Tnni3k相關(guān)的疾病包括擴(kuò)張型心肌病、心臟肥大。與該基因相關(guān)的GO分析包括轉(zhuǎn)移酶活性、磷轉(zhuǎn)移酶活性和蛋白酪氨酸激酶活性^[4]。

心肌肥厚分為生理性心肌肥厚和病理性心肌肥厚，二者都表現(xiàn)出心臟質(zhì)量的增加、心肌細(xì)胞表面積增大、心肌肌小節(jié)組裝增強(qiáng)、蛋白合成增加。生理性的心臟生長(zhǎng)可能由于鍛煉等因素形成，表現(xiàn)為正常的心臟結(jié)構(gòu)，正�；蚋纳频男鹿δ堋２±硇缘男呐K生長(zhǎng)往往發(fā)生于疾病狀況下，如長(zhǎng)期的壓力超負(fù)荷（高血壓，心臟瓣膜疾病）、容量超負(fù)荷（動(dòng)靜脈分流）、心肌梗死或與冠心病關(guān)聯(lián)的缺血、遺傳突變、糖尿病等。

生理性心肌肥厚具有保護(hù)心臟的功能作用，而病理性心肌肥厚最終發(fā)展為心衰。除此之外，病理、生理性肥厚的功能特征主要包括：肌小節(jié)組裝的改變、心肌纖維化的分子機(jī)制改變、心臟能量代謝的改變以及生化與分子生物學(xué)特征的改變^[1]。

Tnni3k基因編輯小鼠
1●Tnni3k條件性敲除小鼠

心肌細(xì)胞條件性Tnni3k純合敲除小鼠表現(xiàn)出對(duì)心臟缺血/再灌注損傷的降低^[5]。

研究人員使用誘導(dǎo)型心肌細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre重組酶系統(tǒng)研究了小鼠Tnni3k基因的功能。之后，對(duì)Tnni3k條件性敲除小鼠（Tnni3k-KO）和野生型同窩小鼠進(jìn)行缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）實(shí)驗(yàn)。24小時(shí)后，Tnni3k-KO的梗塞明顯更�。▓D2B-C），但兩組小鼠的風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域（areas at risk, AAR） 沒有明顯差異（圖2D）。

在I/R誘導(dǎo)之后，Tnni3k-KO的三種損傷標(biāo)志物cTnI、心肌肌鈣蛋白T和肌球蛋白輕鏈在血漿中的水平相較于野生型小鼠低很多。此外，在Tnni3k-KO中，磷酸化p38的含量顯著降低，但磷酸化的ERK1/2、JNK和Akt的含量在兩組小鼠中未發(fā)生明顯改變（圖2F），這表明活化的p38含量的降低對(duì)小鼠心臟具有一定的保護(hù)作用。因此，Tnni3k可以調(diào)控心肌細(xì)胞對(duì)再灌注損傷的反應(yīng)^[6]。
 

圖2. 敲除Tnni3k可減少I/R后梗死面積和p38 MAPK激活。

(B)來自Tnni3k-KO和野生型小鼠中具有代表性的埃文斯藍(lán)和TTC染色切片（每組n=11）。 

(C)梗死面積占AAR面積的百分比。

(D)AAR面積占左心室（left ventricle, LV）面積的百分比。

(E)血漿中cTnI、血漿肌鈣蛋白T（cTnT）和肌球蛋白輕鏈（MLC）的含量。

(F)Tnni3k-KO和野生型小鼠左心室遠(yuǎn)端的Akt、ERK1/2、JNK1/2以及p38 MAPK磷酸化狀態(tài)的代表性WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果（每組n=6）�；叶确治鼋Y(jié)果在WB結(jié)果的右側(cè)。

2●Tnni3k過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠
研究人員首先構(gòu)建了由α-MHC作為啟動(dòng)子的Tnni3k表達(dá)質(zhì)粒，并注射到胚胎中進(jìn)而構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。值得注意的是，使用轉(zhuǎn)基因方式構(gòu)建的小鼠，不同的個(gè)體（或稱為譜系）可能具有不同的基因型或表型。研究人員發(fā)現(xiàn)TG-H譜系的小鼠在3月齡（31.3%）和12月齡（43.1%）的時(shí)候表現(xiàn)出異常的心重/體重比變化（heart weight/body weight, HW/BW）。研究人員之后對(duì)這一譜系的小鼠進(jìn)行了后續(xù)分析。

在3月齡時(shí)，TG-H小鼠的心臟明顯大于野生型同窩小鼠（圖3A）。切片結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠具有同側(cè)心室肥大的表型，并具有腔室尺寸較小、心室壁較厚的特點(diǎn)（圖3B）。鏡下觀察結(jié)果顯示，在TG-H 小鼠中未觀察到壞死或肌細(xì)胞紊亂的現(xiàn)象（圖3C，上圖）。Masson三色染色的結(jié)果顯示TG-H轉(zhuǎn)基因小鼠沒有間質(zhì)纖維化的發(fā)生（圖3C，下圖）。除此之外，研究人員通過H&E染色檢測(cè)心肌細(xì)胞的橫截面積，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TG-H譜系小鼠的心肌細(xì)胞明顯更大，并且，其平均表面積比同窩對(duì)照小鼠大1.8倍（圖3D）^[6]。
 

圖3. Tnni3k過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠3月齡的心臟組織學(xué)分析。
(A)完整心臟的形態(tài)學(xué)照片。
(B)H&E染色后心臟的宏觀視圖，結(jié)果顯示TG-H小鼠同側(cè)心室肥大。
(C)心肌細(xì)胞的組織學(xué)分析，上圖是H&E染色切片，下圖是三色染色切片。
(D)從H&E染色的組織切片中定量心肌細(xì)胞的橫截面積。

小結(jié)
本篇文章介紹了Tnni3k基因，該基因是一個(gè)心臟特異性的激酶，因此其主要功能也與心臟功能有關(guān)，心臟特異性敲除該基因的小鼠在經(jīng)歷心臟缺血/再灌注損傷后，其損傷程度相對(duì)較低，過表達(dá)該基因的小鼠會(huì)出現(xiàn)心臟肥大的表型。目前已經(jīng)有許多Tnni3k的抑制劑，如GSK854，GSK114以及GSK329^[8]，這些抑制劑為心臟病的治療提供了新的思路，除此之外，該基因也是一個(gè)基因治療和基因檢測(cè)的相關(guān)靶標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：
1.王林;TNNI3K促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大、增強(qiáng)肌絲鈣敏感度及nexilin基因調(diào)節(jié)心肌收縮性[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

2.戴洪甜. TNNI3K對(duì)心肌缺血性損傷后心肌細(xì)胞中SDF-1表達(dá)的影響及其機(jī)制研究[D]. 華中科技大學(xué), 2019.

3.Vagnozzi R J ,  Gatto G J ,  Kallander L S , et al. Inhibition of the Cardiomyocyte-Specific Kinase TNNI3K Limits Oxidative Stress, Injury, and Adverse Remodeling in the Ischemic Heart[J]. Science Translational Medicine, 2013, 5(207):207ra141.

4.Wang X ,  Wang J ,  Ming S , et al. TNNI3K, a Cardiac-Specific Kinase, Promotes Physiological Cardiac Hypertrophy in Transgenic Mice[J]. Plos One, 2013, 8(3):e58570.

5.Pham C, Muñoz-Martín N, Lodder EM. The Diverse Roles of TNNI3K in Cardiac Disease and Potential for Treatment. International Journal of Molecular Sciences. 2021; 22(12):6422.