生物分析三劍客：Octet，iQue和Incucyte助力甲病毒受體快速發(fā)現(xiàn)

甲病毒（Alphavirus）是包膜RNA病毒，可引發(fā)皮疹、關(guān)節(jié)痛、急性發(fā)熱疾病，甚至致命的腦炎。該病毒屬包括東方馬腦炎病毒（EEEV）、塞姆利基森林病毒（SFV）、辛德畢斯（SINV）病毒和基孔肯亞病毒（CHIKV）等。病毒包膜蛋白以正二十面體對稱排列，E2和E1糖蛋白形成異質(zhì)二聚體，聚成80個三聚體，介導(dǎo)病毒和細胞膜的受體結(jié)合與融合。
 

甲病毒結(jié)構(gòu)示意圖

近期發(fā)表在Nature期刊的一項研究中^[1]，哈佛醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)極低密度脂蛋白受體（VLDLR）是典型的甲病毒SFV的受體，而EEEV和SINV病毒的E2/E1糖蛋白也與VLDLR的配體結(jié)合域（LBD）相互作用介導(dǎo)病毒進入細胞，受體是與VLDLR密切相關(guān)的載脂蛋白E受體2（ApoER2）。賽多利斯生物分析三劍客——Octet®分子互作分析系統(tǒng)，Incucyte®實時活細胞分析系統(tǒng)以及iQue®高通量流式細胞儀在這篇文章中大放異彩。

1 細胞水平篩選甲病毒受體
利用CRISPR和模擬甲病毒的假病毒系統(tǒng)在細胞水平進行甲病毒受體篩選。將甲病毒復(fù)制子系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為基于DNA的報告病毒顆粒（SFV RVP）系統(tǒng)（或稱之為假病毒），GFP為報告基因。當細胞被假病毒感染后，報告基因被整合到細胞基因組中，表達GFP產(chǎn)生綠色熒光。構(gòu)建針對人類基因組中膜相關(guān)蛋白的向?qū)�RNA(sgRNAs)文庫。使用該文庫對感染SFV RVPs的HEK293T細胞進行CRISPR/Cas9篩選。發(fā)現(xiàn)使VLDLR（極低密度脂蛋白受體）基因沉默可以抑制SFV RVP的干擾，說明VLDLR是SFV的受體。這篇文章有大量數(shù)據(jù)檢測SFV RVP對細胞的相對感染率，iQue®高通量流式細胞儀當仁不讓地成了這個測試的主力。
 

左、中、右分別為活細胞群，單細胞群和GFP陽性細胞群。
相對感染率Relative infection (%) = （加入抗體or阻斷蛋白or受體的GFP陽性細胞/未加入抗體or阻斷蛋白or受體的GFP陽性細胞) × 100%
 

左：VLDLR敲除后，SFV的感染能力大大降低
右：加入VLDLR的抗體，可以阻斷SFV對細胞的感染

iQue®高通量流式細胞儀的優(yōu)勢在于：

iQue® 高通量流式細胞儀

2 分子水平研究甲型病毒
E2/E1蛋白與受體的結(jié)合
為了搞清楚甲病毒E2/E1蛋白是否直接與VLDLR和ApoER2的LBD（ligand binding domain）結(jié)構(gòu)域結(jié)合，作者生成并純化了甲病毒的病毒樣顆粒（VLP）。使用基于生物層干涉(BLI)的Octet®分子互作分析系統(tǒng)進行分析，發(fā)現(xiàn)VLDLR_LBD-Fc可以直接結(jié)合SFV、SINV和EEEV VLP。而RAP（一種VLDLR阻斷劑）可以阻斷甲病毒和VLDLR的結(jié)合。進一步從分子水平驗證了VLDLR的LBD結(jié)構(gòu)域是甲病毒的結(jié)合位點。
 

Octet® Red 96e測試：用AHC（anti-human Fc）傳感器固化受體，然后加入100 μg/mL阻斷蛋白RAP或者Tf，然后與甲病毒VLP (20 nM) 結(jié)合5分鐘

Octet®分子互作分析系統(tǒng)的優(yōu)勢在于：
· 非標記Direct binding是趨勢，結(jié)果更準確；
· 快速測定親和力，更加定量化地表征分子互作；
· 無洗滌步驟，可測弱親和力（解離快）；
· 寫入了美國藥典，文章多，認可度廣；
· 萬金油技術(shù)，可以用于檢測DNA，小分子，蛋白質(zhì)等各種生物分子，比如這篇文章檢測的就是病毒顆粒樣品；
· 操作簡便，耗材及維護成本低。
 

3 細胞成像研究
病毒對細胞的感染
皮質(zhì)神經(jīng)元是甲病毒感染的細胞種類之一，并引起腦炎。用Incucyte®實時活細胞分析儀檢測了甲病毒對神經(jīng)元的感染率。加入VLDLR的LBD結(jié)構(gòu)域或者RAP，可以阻斷甲病毒的感染。
 

用Incucyte® S3檢測iPSC分化的神經(jīng)元對SFV RVP的感染。GCU閾值5，用Top-hat算法進行背景扣除。經(jīng)過22小時培養(yǎng)后，計算GFP熒光面積。相對感染率Relative infection (%) = （加入抗體or阻斷蛋白or受體的GFP陽性細胞/未加入抗體or阻斷蛋白or受體的GFP陽性細胞) × 100%

Incucyte®實時活細胞分析系統(tǒng)優(yōu)勢在于：
· 貼壁生長的神經(jīng)細胞相對其他細胞比較脆弱，Incucyte® S3放入培養(yǎng)箱中，不需要移動培養(yǎng)板，對拍照的人為干擾最小。而流式等技術(shù)需要對細胞消化處理，可能會大大影響其活性和檢測的準確性；
· 配備無毒害免干擾的活細胞分析試劑，智能的神經(jīng)細胞分析軟件，以及趨化、遷移、3D腫瘤球和類器官模塊；
· 通量高，一次可同時進行多達6塊多孔板的實驗，靈活選擇不同的物鏡和熒光通道。
 

天下武功，唯快不破。賽多利斯生物分析三劍客——Octet®，iQue®和Incucyte®相比同類檢測工具都具備更高的通量及功能，可以幫助藥物研發(fā)和科研工作者快速拿到準確的數(shù)據(jù)，在內(nèi)卷的環(huán)境中迅速占領(lǐng)一席之地！

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《生物層干涉技術(shù)應(yīng)用文集
——病毒學(xué)基礎(chǔ)研究及藥物研發(fā)》

本文集通過對 Octet® 在病毒研究中分子結(jié)合動力學(xué)相關(guān)應(yīng)用的梳理和分析，希望能夠給廣大科研工作者在病毒致病機理、病毒藥物發(fā)現(xiàn)、病毒診斷檢測、病毒疫苗研究等不同領(lǐng)域帶來啟示和幫助，促進我國病毒學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。
 

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