呼出氣冷凝液（EBC）采集與分析應(yīng)用研究
一、呼出氣冷凝液及其組成
呼吸是人體重要的生理過程，呼出氣的主要成分是水蒸氣，同時還含有二氧化碳等其他氣體和物質(zhì)。呼出氣冷凝液（Exhaled Breath Condensate，簡稱EBC）是在呼出氣采集裝置的輔助下，將呼出氣快速低溫（如-5℃）冷凝成的液體。
從來源看，呼出氣冷凝液（EBC）是在無創(chuàng)條件下獲得的下呼吸道襯液，推測認為是呼吸氣流形成“氣旋”將氣道內(nèi)襯液“刮落”或是吸氣時氣道擴張形成的張力將表層液相“撕裂”所致。EBC中大約含有0.1% 呼吸道襯里液滴和99%的水蒸氣，即1mL的EBC僅含有0.1μL呼吸道襯里液，因此，EBC是一種內(nèi)容物濃度極低的高度稀釋的基質(zhì)。從呼出氣冷凝液的組分來看，其組分十分復(fù)雜，包括多種無機氣體、揮發(fā)性有機化合物、低揮發(fā)性的有機分子，如醛類、脂肪酸和多肽等、過氧化氫（H2O2）、無機鹽類如硝酸鹽、生物大分子如蛋白質(zhì)與核酸，以及含有細菌、病毒和真菌的生物氣溶膠等等（見下表一）。
二、呼出氣冷凝液生物標志物（biomarker）的研究和臨床應(yīng)用
在Medline（生物醫(yī)學(xué)）數(shù)據(jù)庫中搜索呼出氣冷凝液相關(guān)文獻，通過PubMed使用 “Exhaled breath condensate”關(guān)鍵詞可搜索到1705篇文獻（2001~2021年）；通過PubMed使用“Exhaled breath condensate and biomarker”兩個關(guān)鍵詞可搜索到相關(guān)文獻894篇（2001~2021年），可見人們對呼出氣冷凝液（EBC）的研究熱情一直非常高，且創(chuàng)新性論文增長迅速，幾乎涵蓋現(xiàn)代呼吸醫(yī)學(xué)的所有領(lǐng)域。
I.生物標志物的研究
大量研究表明，呼出氣冷凝液中的多種生化物質(zhì)的濃度變化（或有無的變化）與呼吸系統(tǒng)的病理狀態(tài)密切相關(guān)，這些生化物質(zhì)被稱為潛在的生物標志物（biomarkers），它們很有希望應(yīng)用于臨床診斷：科研工作者通過收集并分析含有生物標志物的EBC樣本，從中發(fā)現(xiàn)各種生物標志物與疾病之間的關(guān)系，進而深入了解和洞悉疾病的發(fā)生發(fā)展機制和機理等，應(yīng)用于如肺癌的早期診斷和高危人群中的篩查；哮喘、慢性阻塞性肺疾�。–OPD）等呼吸道疾病的動態(tài)監(jiān)測、療效驗證和病情評估等方面。
與呼吸道炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的潛在的多種生物標志物得到廣泛而充分的研究。如pH、過氧化氫，白三烯（LTs)，8-異前列腺素和細胞因子等生物標志物。
pH代表呼吸道表面黏液的酸化程度，呼吸道的炎癥與氣道酸化即EBC-pH降低相關(guān)，如研究表明哮喘加重期、COPD 患者的EBC-pH較正常人低，支氣管哮喘的吸煙人群EBC-pH 降低。
過氧化氫（H2O2）是人體氧化應(yīng)激的標志性產(chǎn)物之一。EBC-H2O2的水平與肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺纖維化等疾病的關(guān)系都有深入的研究。如研究發(fā)現(xiàn)：非吸煙者哮喘患者的EBC-H2O2水平顯著高于健康受試者，特別是成人哮喘患者的EBC-H2O2水平高于健康受試者，而哮喘患兒EBC-H2O2濃度與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，EBC-H2O2水平與哮喘的嚴重程度和控制狀態(tài)相關(guān)，所以過氧化氫有可能作為指導(dǎo)哮喘治療的生物標志物。大量研究發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者中EBC-H2O2也顯著升高，但急性COPD患者經(jīng)治療后EBC-H2O2降低。
白三烯（LTs）是白細胞產(chǎn)生的花生四烯酸（AA）經(jīng)5-脂氧合酶（5-LOX）途徑代謝產(chǎn)生的一組炎性介質(zhì)，包括白三烯B4(LTB4)、半胱氨�；兹�(CysLTs)等，其中白三烯B4(LTB4)是目前所知作用最強的粒細胞趨化因子，如在哮喘和COPD患者中能發(fā)現(xiàn)EBC-LTB4的升高。半胱氨�；兹�(CysLTs)具有誘導(dǎo)平滑肌收縮，增加血管通透性，刺激黏液分泌并減少黏膜纖毛清除率等作用，它們參與包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支氣管哮喘、支氣管擴張等多種氣道炎癥性疾病的發(fā)病過程。前列腺素E2（PGE2）和8-異前列腺素也是花生四烯酸的衍生產(chǎn)物，PGE2有促炎作用和抑制支氣管收縮，EBC-PGE2水平的升高可能反映了哮喘患者的吸煙狀況。 8-異前列腺素是花生四烯酸被自由基氧化后生成的產(chǎn)物，被認為是測定體內(nèi)氧化應(yīng)激的金指標。在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、急性肺損傷、哮喘和兒童呼吸道炎癥等多種肺部疾病中，研究發(fā)現(xiàn)EBC-8-isoPG水平都有顯著的升高。
細胞因子(cytokine，CK)是由多種組織細胞（主要為免疫細胞）所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，它們具有調(diào)節(jié)細胞生長、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)、腫瘤消長等多種生物學(xué)功能。在EBC中發(fā)現(xiàn)了多種與哮喘，COPD及肺癌相關(guān)的細胞因子生物標志物。如促炎細胞因子白細胞介素（ILs），其中IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10和IL-17在哮喘穩(wěn)定期表達升高；兒童哮喘人群中，EBC-IL-4水平升高，同時干擾素γ水平降低。腫瘤壞死因子TNF-α也是炎癥標志物之一，在急性COPD,哮喘和肺癌患者中均發(fā)現(xiàn)EBC-TNF-α水平升高。
下表二中列舉了部分文獻報道的生物標志物的研究成果。
應(yīng)該指出的是，近些年來，EBC蛋白質(zhì)組分析、基因組分析以及代謝組學(xué)分析的研究越來越多。EBC組學(xué)分析取得了很多令人印象深刻的研究結(jié)果。如對EBC的廣泛蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了與哮喘的病理生理機制相關(guān)的生物標志物。在Bloemen 等人的研究中，哮喘兒童的EBC-細胞角蛋白1水平顯著高于健康對照組，而EBC-細胞角蛋白2、5、6、8、9、10、14和16、白蛋白、肌動蛋白、血紅蛋白、溶菌酶、鈣顆粒蛋白B和結(jié)蛋白的濃度沒有顯著差異。在EBC基因組分析方面，如對肺癌患者的EBC基因組分析，檢測到p53基因的體細胞突變，而在健康對照組中未檢測到；對NSCLC患者的EBC分析發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星DNA不穩(wěn)定性和雜合性缺失：3p染色體(位點D3S2338、D3S1266、D3S1304、D3S1289)。對重度吸煙者和NSCLC患者中都發(fā)現(xiàn)了相同的微衛(wèi)星EBC-DNA變化。Eva Borras等人研究了流感感染者和流感疫苗接種者的呼出氣冷凝液的生物標志物。通過液相色譜法結(jié)合四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（LC-qTOF）的檢測技術(shù)對呼出冷凝液（EBC）樣品進行分析，使用靶向和非靶向方法分析所有代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，以檢測炎癥和氧化應(yīng)激生物標記物中的特定已知生物標記物，以及與特定感染相關(guān)的新分子。研究結(jié)果表明能夠找到流感疫苗接種前后采集的呼吸樣本之間的明顯差異，以及與炎癥過程和氧化應(yīng)激相關(guān)的潛在生物標志物等。這些結(jié)果為進一步研究甲型流感和其他病毒在人體系統(tǒng)中的作用提供了非常有希望的信息。Annalisa Campanella等則根據(jù)EBC肺癌候選生物標記物的來源（基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組、代謝組、蛋白質(zhì)組和微生物群）將其進行分類，證明EBC分析在癌癥診斷、分子分析、治療監(jiān)測和高危人群篩查中的潛在用途。
II.臨床應(yīng)用
分析廣泛應(yīng)用于肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、職業(yè)性肺損傷等肺部疾病的臨床研究，也有不少關(guān)于細菌或病毒性呼吸道感染，包括最近兩年來席卷全球的新冠病毒肺炎的研究報道。前面討論EBC的生物標志物時能夠看到很多的EBC分析在肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病等肺部疾病的臨床應(yīng)用的例子，在此不再贅述。
在EBC-細菌和病毒研究方面，如Yunhao Zheng等人使用商業(yè)化的EBC收集裝置(北京鼎藍BioScreenII)與LAMP（環(huán)介等溫擴增）方法相結(jié)合,研究呼吸道感染癥狀的受試者的EBC中可能存在的細菌性病原微生物。研究結(jié)果證明流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和MRSA，可以通過呼出的氣體從感染者中釋放出來,也證明了流感嗜血桿菌是導(dǎo)致常見呼吸道感染的主要病原體。研究表明EBC結(jié)合LAMP分析方案提供了一種可能的快速、有效、無創(chuàng)的感染病原體的診斷方法。
在新冠病毒肺炎的臨床應(yīng)用方面，在pubmed中輸入“Exhaled Breath Condensate，COVID-19”關(guān)鍵詞，可搜索到15篇相關(guān)文獻，這些研究為EBC分析在新冠肺炎的臨床診斷等方面做了初步而有益的探索。如Makoto Sawano等收集48名2019-冠狀病毒疾病患者的EBC樣本，并結(jié)合RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）技術(shù)（即RT-PCR）定量分析病毒的靶向E基因來確定病毒載量，對檢測率和病毒載量相對于患者特征和發(fā)病天數(shù)的變化進行統(tǒng)計評估，研究結(jié)果表明需要機械通氣與較高的病毒載量顯著相關(guān)（p<0.05）；需要吸氧或機械通氣、發(fā)病后少于3天、咳嗽或發(fā)熱與較高的檢出率顯著相關(guān)（p<0.05）。在自發(fā)呼吸患者中，EBC-病毒載量隨時間呈指數(shù)衰減。發(fā)病后第2天的檢出率為86%，此后惡化。在機械通氣患者中，無論發(fā)病后幾天，檢出率和病毒載量都很高。這些結(jié)果支持了對發(fā)病后2天內(nèi)的COVID-19患者使用RT-PCR技術(shù)檢測EBC-新冠病毒的可行性。
三、呼出氣冷凝液采集裝置與技術(shù)
I.呼出氣冷凝液采集裝置
目前臨床研究上絕大多數(shù)EBC收集裝置為商業(yè)化采集器，如R-Tube、EcoScreen、TURBO-DECCS、ANACON、BioscreenII等，適用范圍包括自主呼吸和機械通氣的患者。我們以呼出氣采集器BioscreenII為例來介紹呼出氣冷凝液的采集裝置及技術(shù)。
BioscreenII是北京鼎藍科技有限公司研發(fā)的呼出氣冷凝液采集器，是一款便攜且快速采集呼出氣冷凝液（Exhaled Breath Condensate, EBC）的裝置（見圖1左）。該采集裝置由采集器主機、電源適配器和一次性無菌采樣耗材（分離蓋、采集管和吹氣管）組成。（設(shè)備詳情請參考：http://www.dingbluetech.com/product/278199832）
BiscreenII的主要特點：（1） BioscreenII采用了先進的半導(dǎo)體制冷元器件和電動制冷方式，平均降溫速率為5℃/min；選用50ml離心管，加大冷凝接觸面積，進一步加快冷凝速度，使呼出氣迅速液化形成冷凝液；（2）采集溫度為-5℃~0℃，出廠默認-4℃，且能實時顯示冷凝溫度；（3）特有的分離蓋設(shè)計，使呼出氣在離心管內(nèi)形成旋風(fēng)氣流，推動水霧形成液滴，減少液膜形成，同時可不斷吹落側(cè)壁冷凝液滴，匯集到冷凝管底部，提高了樣品收集率，采集效率為200μL/min，3～5分鐘就可采集0.5～1ml冷凝液；同時使采集者呼出的氣體與唾液有效分離；(4)該裝置外形尺寸為255*215*120mm，總重量2.0kg，輕巧便攜。
圖1 呼出氣采集器BioscreenII（左）和 呼出氣冷凝液的采集（右）
II.呼出氣冷凝液采集技術(shù)
與支氣管肺泡灌洗(BAL)等具有相對侵入性和挑戰(zhàn)性的技術(shù)方法相比，呼出氣冷凝液的采集無疑是一種先進的無創(chuàng)、輕松、無痛的技術(shù)，只需要被采集者簡單地潮汐呼吸。
（1）采集原理
患者在平靜呼吸時將呼出氣吹進低溫密閉采集裝置（見圖1右），同時裝置的冷凝系統(tǒng)使氣體凝結(jié)形成液滴并收集在采集管中，采集的樣品可進一步低溫儲存或檢測分析。
（2）采集過程
采集前，被采集者應(yīng)該避免運動、抽煙或者進食一些特殊的食物如咖啡因類飲料、碳酸飲料等，因為有研究表明抽煙和特殊成分的飲料會導(dǎo)致EBCD的某些生物標志物濃度的變化；采集前先清水（或特定的溶液）漱口，休息十分鐘，保持呼吸平靜。當(dāng)采集器的準備工作完畢，采集冷凝溫度降至-5℃時，被采集者對吹氣管均勻正常地吹氣：吹氣時保持用鼻吸氣，用嘴呼；盡量將肺部余氣吹出，有利于提高內(nèi)容物的檢出率。吹氣采集時間一般為3～5分鐘，采集結(jié)束后，立刻取出采集管進行低溫儲存或用于檢測分析。
（3）注意事項
采集過程中需要特別注意的兩個問題：一是防止EBC樣品的污染，如在采集過程中防止采集管的污染，防止唾液、口腔和上呼吸道的內(nèi)容物等對EBC的污染等。二是采集的EBC樣品的維護，可根據(jù)檢測分析的需要采取合適的低溫（如-70℃）存儲以防止樣品中的生化物質(zhì)的降解變質(zhì)，必要時需將樣品分裝保存以防止EBC 樣品的反復(fù)凍融等。
（4）面臨的問題
各種不同品牌的商業(yè)化呼出氣冷凝液采集器被廣泛應(yīng)用于EBC的研究，但研究者也注意到一些問題：（1）環(huán)境條件的不同，采集器裝置和采集操作的不同，都可能導(dǎo)致采集到的呼出氣冷凝液“內(nèi)容物”有所不同。如有研究表明環(huán)境溫度和相對濕度對EBC-pH的變化有貢獻；EBC中的過氧化氫水平在48-140mL/s的呼氣流量下具有流量依賴性等。所以，對不同品牌收集器的呼出氣冷凝液進行比較研究，對EBC收集操作進行標準化也是EBC研究面臨的課題之一。（2）另一個應(yīng)用的難題是EBC是一種含有大量水蒸氣的基質(zhì)，因此大多數(shù)生物標志物被高度稀釋，接近較低的檢測靈敏度極限，有必要建立一個能夠反映氣道中各生物標志物實際水平的EBC稀釋指標，但目前還沒有金標準稀釋因子（gold standard dilution factor）被定義并廣泛用于研究。另外，從采集的角度來看，更有效地采集與富集裝置也有待研究，如研究發(fā)現(xiàn)：將呼出氣冷凝液（EBC）凍干再進行檢測分析，則其生物標志物的濃度可有效提高20倍。
四，總結(jié)與展望
EBC分析是一種有臨床應(yīng)用前景的肺功能指標檢測新技術(shù)。一方面，呼出氣冷凝液(EBC)提供了一種新的診斷呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的生物標志物的標本，通過分析EBC的生物標志物的變化，可提供下呼吸道和肺部可能的病理狀態(tài)的信號，用于疾病早期的診斷、篩查，監(jiān)測病情進程與療效評估，也能為疾病的發(fā)生、發(fā)展機制提供諸多有用信息等。另一方面，呼出氣冷凝液收集設(shè)備具有便攜的特點，且收集不受年齡、性別、病情程度的影響與限制等，幾乎可以應(yīng)用于所有患者，包括小兒患者、機械通氣患者及昏迷患者等。因此，EBC分析作為一種完全無創(chuàng)、簡便快捷、應(yīng)用人群廣泛、可實現(xiàn)疾病動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)勢的新技術(shù)，受到眾多的醫(yī)學(xué)與科研工作者的重視與青睞。
目前EBC的研究還處于臨床應(yīng)用的初級階段，尚還存在著很多亟待解決的問題，其中最主要的問題是“標準化”的問題：如（1）呼出氣冷凝液作為一種如同血液，尿液的生化標本，其組分十分復(fù)雜，尚無大規(guī)模人群的研究報道，缺乏各種生物標志物在EBC中的正常參考值；（2）確定的正常人的呼出氣冷凝液的蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和基因組學(xué)“指紋”還沒有被發(fā)現(xiàn)和沒有被充分描述；（3）現(xiàn)有的知識（knowledge）基于小規(guī)模研究提供的數(shù)據(jù)，通常顯示出相互矛盾的結(jié)果，可能歸因于EBC生物標記物的再現(xiàn)性差；（4）EBC的稀釋度在個體間存在著很大的差異，目前尚缺乏確定EBC稀釋度統(tǒng)一的方法，從而可能會影響對檢測結(jié)果的評估；（5）研究者所用的設(shè)備或收集及檢測方法技術(shù)不同，可能得出不同的結(jié)果，也使得結(jié)果之間缺乏可比性等等。
總而言之，EBC分析是生物醫(yī)學(xué)研究的一項有趣的成就，也是一項有希望成為肺部疾病及全身性疾病診斷的重要技術(shù)。特別是近些年來，隨著基因組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等生命學(xué)科的飛速發(fā)展，同時分子檢測分析技術(shù)也在高速發(fā)展，如高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)，核酸擴增-檢測技術(shù)，以及生物樣品處理與富集技術(shù)的突破與發(fā)展等，為EBC分析開拓了以蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子及細菌病毒微生物氣溶膠為生物標志物的研究新視角和新領(lǐng)域。
主要參考文獻：
呼吸是人體重要的生理過程，呼出氣的主要成分是水蒸氣，同時還含有二氧化碳等其他氣體和物質(zhì)。呼出氣冷凝液（Exhaled Breath Condensate，簡稱EBC）是在呼出氣采集裝置的輔助下，將呼出氣快速低溫（如-5℃）冷凝成的液體。
從來源看，呼出氣冷凝液（EBC）是在無創(chuàng)條件下獲得的下呼吸道襯液，推測認為是呼吸氣流形成“氣旋”將氣道內(nèi)襯液“刮落”或是吸氣時氣道擴張形成的張力將表層液相“撕裂”所致。EBC中大約含有0.1% 呼吸道襯里液滴和99%的水蒸氣，即1mL的EBC僅含有0.1μL呼吸道襯里液，因此，EBC是一種內(nèi)容物濃度極低的高度稀釋的基質(zhì)。從呼出氣冷凝液的組分來看，其組分十分復(fù)雜，包括多種無機氣體、揮發(fā)性有機化合物、低揮發(fā)性的有機分子，如醛類、脂肪酸和多肽等、過氧化氫（H2O2）、無機鹽類如硝酸鹽、生物大分子如蛋白質(zhì)與核酸，以及含有細菌、病毒和真菌的生物氣溶膠等等（見下表一）。
表一 呼出氣及冷凝液主要組成成分
| 呼出氣及冷凝液分類 | 組分 |
| 呼出氣（37℃） | Water Vapor（水蒸氣）, CO2, O2, N2, NO, CO |
| 揮發(fā)性物質(zhì) | VOCs（有機物）, linear aldehydes（乙醛類）, ammonia（氨類）, free radicals（自由基）等 |
| 低度揮發(fā)性物質(zhì) | products of peroxidation（氧化反應(yīng)產(chǎn)物）, H2O2 , 其他醛、脂肪酸、脂質(zhì)等 |
| 非揮發(fā)性物質(zhì) | 金屬離子、非金屬離子、無機鹽、蛋白質(zhì)、DNA、生物氣溶膠等 |
在Medline（生物醫(yī)學(xué)）數(shù)據(jù)庫中搜索呼出氣冷凝液相關(guān)文獻，通過PubMed使用 “Exhaled breath condensate”關(guān)鍵詞可搜索到1705篇文獻（2001~2021年）；通過PubMed使用“Exhaled breath condensate and biomarker”兩個關(guān)鍵詞可搜索到相關(guān)文獻894篇（2001~2021年），可見人們對呼出氣冷凝液（EBC）的研究熱情一直非常高，且創(chuàng)新性論文增長迅速，幾乎涵蓋現(xiàn)代呼吸醫(yī)學(xué)的所有領(lǐng)域。
I.生物標志物的研究
大量研究表明，呼出氣冷凝液中的多種生化物質(zhì)的濃度變化（或有無的變化）與呼吸系統(tǒng)的病理狀態(tài)密切相關(guān)，這些生化物質(zhì)被稱為潛在的生物標志物（biomarkers），它們很有希望應(yīng)用于臨床診斷：科研工作者通過收集并分析含有生物標志物的EBC樣本，從中發(fā)現(xiàn)各種生物標志物與疾病之間的關(guān)系，進而深入了解和洞悉疾病的發(fā)生發(fā)展機制和機理等，應(yīng)用于如肺癌的早期診斷和高危人群中的篩查；哮喘、慢性阻塞性肺疾�。–OPD）等呼吸道疾病的動態(tài)監(jiān)測、療效驗證和病情評估等方面。
與呼吸道炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的潛在的多種生物標志物得到廣泛而充分的研究。如pH、過氧化氫，白三烯（LTs)，8-異前列腺素和細胞因子等生物標志物。
pH代表呼吸道表面黏液的酸化程度，呼吸道的炎癥與氣道酸化即EBC-pH降低相關(guān)，如研究表明哮喘加重期、COPD 患者的EBC-pH較正常人低，支氣管哮喘的吸煙人群EBC-pH 降低。
過氧化氫（H2O2）是人體氧化應(yīng)激的標志性產(chǎn)物之一。EBC-H2O2的水平與肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺纖維化等疾病的關(guān)系都有深入的研究。如研究發(fā)現(xiàn)：非吸煙者哮喘患者的EBC-H2O2水平顯著高于健康受試者，特別是成人哮喘患者的EBC-H2O2水平高于健康受試者，而哮喘患兒EBC-H2O2濃度與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，EBC-H2O2水平與哮喘的嚴重程度和控制狀態(tài)相關(guān)，所以過氧化氫有可能作為指導(dǎo)哮喘治療的生物標志物。大量研究發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者中EBC-H2O2也顯著升高，但急性COPD患者經(jīng)治療后EBC-H2O2降低。
白三烯（LTs）是白細胞產(chǎn)生的花生四烯酸（AA）經(jīng)5-脂氧合酶（5-LOX）途徑代謝產(chǎn)生的一組炎性介質(zhì)，包括白三烯B4(LTB4)、半胱氨�；兹�(CysLTs)等，其中白三烯B4(LTB4)是目前所知作用最強的粒細胞趨化因子，如在哮喘和COPD患者中能發(fā)現(xiàn)EBC-LTB4的升高。半胱氨�；兹�(CysLTs)具有誘導(dǎo)平滑肌收縮，增加血管通透性，刺激黏液分泌并減少黏膜纖毛清除率等作用，它們參與包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支氣管哮喘、支氣管擴張等多種氣道炎癥性疾病的發(fā)病過程。前列腺素E2（PGE2）和8-異前列腺素也是花生四烯酸的衍生產(chǎn)物，PGE2有促炎作用和抑制支氣管收縮，EBC-PGE2水平的升高可能反映了哮喘患者的吸煙狀況。 8-異前列腺素是花生四烯酸被自由基氧化后生成的產(chǎn)物，被認為是測定體內(nèi)氧化應(yīng)激的金指標。在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、急性肺損傷、哮喘和兒童呼吸道炎癥等多種肺部疾病中，研究發(fā)現(xiàn)EBC-8-isoPG水平都有顯著的升高。
細胞因子(cytokine，CK)是由多種組織細胞（主要為免疫細胞）所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，它們具有調(diào)節(jié)細胞生長、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、參與炎癥反應(yīng)、腫瘤消長等多種生物學(xué)功能。在EBC中發(fā)現(xiàn)了多種與哮喘，COPD及肺癌相關(guān)的細胞因子生物標志物。如促炎細胞因子白細胞介素（ILs），其中IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10和IL-17在哮喘穩(wěn)定期表達升高；兒童哮喘人群中，EBC-IL-4水平升高，同時干擾素γ水平降低。腫瘤壞死因子TNF-α也是炎癥標志物之一，在急性COPD,哮喘和肺癌患者中均發(fā)現(xiàn)EBC-TNF-α水平升高。
下表二中列舉了部分文獻報道的生物標志物的研究成果。
表二 呼出氣冷凝液潛在的生物標志物與相關(guān)疾病的關(guān)系
| 生物標志物（biomarker） | 相關(guān)疾�。≧elated Disease） |
| pH | 哮喘加重期、COPD 患者的EBC-pH較正常人低；支氣管哮喘的吸煙人群pH 降低；穩(wěn)定期哮喘患者和健康對照組之間的EBC-pH沒有統(tǒng)計學(xué)差異 |
| 過氧化氫（H2O2） | 哮喘、COPD等呼吸道炎性疾病的成年患者H2O2顯著增加；肺癌H2O2增加 |
| 亞硝酸鹽 | 急性COPD加重期升高 |
| 白三烯(LTs) | 哮喘患者LTB4和半胱氨酰基白三烯(CysLTs)增加； COPD和非小細胞肺癌(NSCLC)患者的EBC-LTB4升高 |
| 前列腺素（PGE2） | 吸煙的哮喘患者PGE2升高 |
| 8-異前列腺素（8-isoPG） | 哮喘患者（成人和兒童）8-isoPG升高 |
| 細胞因子ILs | 哮喘患者的EBC-ILs升高；COPD 患者的IL-1β，IL-6，IL-8，IL-10，IL-12p70升高；肺癌患者 IL-6 等指標升高； EBC-IL-2水平與肺炎嚴重程度相關(guān) |
| 細胞因子TNF-α | 肺癌，急性COPD與穩(wěn)定期哮喘EBC-TNF-α升高；EBC-TNF-α水平與肺炎相關(guān) |
| 趨化因子RANTES | 與哮喘嚴重程度正相關(guān) |
| EBC基因組分析 |
肺癌患者的EBC-p53體細胞突變；非小細胞肺癌(NSCLC)患者的DAPK、PAX5和p16基因的甲基化； 非小細胞肺癌(NSCLC)患者發(fā)現(xiàn)有HPV基因組 |
應(yīng)該指出的是，近些年來，EBC蛋白質(zhì)組分析、基因組分析以及代謝組學(xué)分析的研究越來越多。EBC組學(xué)分析取得了很多令人印象深刻的研究結(jié)果。如對EBC的廣泛蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了與哮喘的病理生理機制相關(guān)的生物標志物。在Bloemen 等人的研究中，哮喘兒童的EBC-細胞角蛋白1水平顯著高于健康對照組，而EBC-細胞角蛋白2、5、6、8、9、10、14和16、白蛋白、肌動蛋白、血紅蛋白、溶菌酶、鈣顆粒蛋白B和結(jié)蛋白的濃度沒有顯著差異。在EBC基因組分析方面，如對肺癌患者的EBC基因組分析，檢測到p53基因的體細胞突變，而在健康對照組中未檢測到；對NSCLC患者的EBC分析發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星DNA不穩(wěn)定性和雜合性缺失：3p染色體(位點D3S2338、D3S1266、D3S1304、D3S1289)。對重度吸煙者和NSCLC患者中都發(fā)現(xiàn)了相同的微衛(wèi)星EBC-DNA變化。Eva Borras等人研究了流感感染者和流感疫苗接種者的呼出氣冷凝液的生物標志物。通過液相色譜法結(jié)合四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（LC-qTOF）的檢測技術(shù)對呼出冷凝液（EBC）樣品進行分析，使用靶向和非靶向方法分析所有代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，以檢測炎癥和氧化應(yīng)激生物標記物中的特定已知生物標記物，以及與特定感染相關(guān)的新分子。研究結(jié)果表明能夠找到流感疫苗接種前后采集的呼吸樣本之間的明顯差異，以及與炎癥過程和氧化應(yīng)激相關(guān)的潛在生物標志物等。這些結(jié)果為進一步研究甲型流感和其他病毒在人體系統(tǒng)中的作用提供了非常有希望的信息。Annalisa Campanella等則根據(jù)EBC肺癌候選生物標記物的來源（基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組、代謝組、蛋白質(zhì)組和微生物群）將其進行分類，證明EBC分析在癌癥診斷、分子分析、治療監(jiān)測和高危人群篩查中的潛在用途。
II.臨床應(yīng)用
分析廣泛應(yīng)用于肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、職業(yè)性肺損傷等肺部疾病的臨床研究，也有不少關(guān)于細菌或病毒性呼吸道感染，包括最近兩年來席卷全球的新冠病毒肺炎的研究報道。前面討論EBC的生物標志物時能夠看到很多的EBC分析在肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病等肺部疾病的臨床應(yīng)用的例子，在此不再贅述。
在EBC-細菌和病毒研究方面，如Yunhao Zheng等人使用商業(yè)化的EBC收集裝置(北京鼎藍BioScreenII)與LAMP（環(huán)介等溫擴增）方法相結(jié)合,研究呼吸道感染癥狀的受試者的EBC中可能存在的細菌性病原微生物。研究結(jié)果證明流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和MRSA，可以通過呼出的氣體從感染者中釋放出來,也證明了流感嗜血桿菌是導(dǎo)致常見呼吸道感染的主要病原體。研究表明EBC結(jié)合LAMP分析方案提供了一種可能的快速、有效、無創(chuàng)的感染病原體的診斷方法。
在新冠病毒肺炎的臨床應(yīng)用方面，在pubmed中輸入“Exhaled Breath Condensate，COVID-19”關(guān)鍵詞，可搜索到15篇相關(guān)文獻，這些研究為EBC分析在新冠肺炎的臨床診斷等方面做了初步而有益的探索。如Makoto Sawano等收集48名2019-冠狀病毒疾病患者的EBC樣本，并結(jié)合RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）技術(shù)（即RT-PCR）定量分析病毒的靶向E基因來確定病毒載量，對檢測率和病毒載量相對于患者特征和發(fā)病天數(shù)的變化進行統(tǒng)計評估，研究結(jié)果表明需要機械通氣與較高的病毒載量顯著相關(guān)（p<0.05）；需要吸氧或機械通氣、發(fā)病后少于3天、咳嗽或發(fā)熱與較高的檢出率顯著相關(guān)（p<0.05）。在自發(fā)呼吸患者中，EBC-病毒載量隨時間呈指數(shù)衰減。發(fā)病后第2天的檢出率為86%，此后惡化。在機械通氣患者中，無論發(fā)病后幾天，檢出率和病毒載量都很高。這些結(jié)果支持了對發(fā)病后2天內(nèi)的COVID-19患者使用RT-PCR技術(shù)檢測EBC-新冠病毒的可行性。
三、呼出氣冷凝液采集裝置與技術(shù)
I.呼出氣冷凝液采集裝置
目前臨床研究上絕大多數(shù)EBC收集裝置為商業(yè)化采集器，如R-Tube、EcoScreen、TURBO-DECCS、ANACON、BioscreenII等，適用范圍包括自主呼吸和機械通氣的患者。我們以呼出氣采集器BioscreenII為例來介紹呼出氣冷凝液的采集裝置及技術(shù)。
BioscreenII是北京鼎藍科技有限公司研發(fā)的呼出氣冷凝液采集器，是一款便攜且快速采集呼出氣冷凝液（Exhaled Breath Condensate, EBC）的裝置（見圖1左）。該采集裝置由采集器主機、電源適配器和一次性無菌采樣耗材（分離蓋、采集管和吹氣管）組成。（設(shè)備詳情請參考：http://www.dingbluetech.com/product/278199832）
BiscreenII的主要特點：（1） BioscreenII采用了先進的半導(dǎo)體制冷元器件和電動制冷方式，平均降溫速率為5℃/min；選用50ml離心管，加大冷凝接觸面積，進一步加快冷凝速度，使呼出氣迅速液化形成冷凝液；（2）采集溫度為-5℃~0℃，出廠默認-4℃，且能實時顯示冷凝溫度；（3）特有的分離蓋設(shè)計，使呼出氣在離心管內(nèi)形成旋風(fēng)氣流，推動水霧形成液滴，減少液膜形成，同時可不斷吹落側(cè)壁冷凝液滴，匯集到冷凝管底部，提高了樣品收集率，采集效率為200μL/min，3～5分鐘就可采集0.5～1ml冷凝液；同時使采集者呼出的氣體與唾液有效分離；(4)該裝置外形尺寸為255*215*120mm，總重量2.0kg，輕巧便攜。
圖1 呼出氣采集器BioscreenII（左）和 呼出氣冷凝液的采集（右）
II.呼出氣冷凝液采集技術(shù)
與支氣管肺泡灌洗(BAL)等具有相對侵入性和挑戰(zhàn)性的技術(shù)方法相比，呼出氣冷凝液的采集無疑是一種先進的無創(chuàng)、輕松、無痛的技術(shù)，只需要被采集者簡單地潮汐呼吸。
（1）采集原理
患者在平靜呼吸時將呼出氣吹進低溫密閉采集裝置（見圖1右），同時裝置的冷凝系統(tǒng)使氣體凝結(jié)形成液滴并收集在采集管中，采集的樣品可進一步低溫儲存或檢測分析。
（2）采集過程
采集前，被采集者應(yīng)該避免運動、抽煙或者進食一些特殊的食物如咖啡因類飲料、碳酸飲料等，因為有研究表明抽煙和特殊成分的飲料會導(dǎo)致EBCD的某些生物標志物濃度的變化；采集前先清水（或特定的溶液）漱口，休息十分鐘，保持呼吸平靜。當(dāng)采集器的準備工作完畢，采集冷凝溫度降至-5℃時，被采集者對吹氣管均勻正常地吹氣：吹氣時保持用鼻吸氣，用嘴呼；盡量將肺部余氣吹出，有利于提高內(nèi)容物的檢出率。吹氣采集時間一般為3～5分鐘，采集結(jié)束后，立刻取出采集管進行低溫儲存或用于檢測分析。
（3）注意事項
采集過程中需要特別注意的兩個問題：一是防止EBC樣品的污染，如在采集過程中防止采集管的污染，防止唾液、口腔和上呼吸道的內(nèi)容物等對EBC的污染等。二是采集的EBC樣品的維護，可根據(jù)檢測分析的需要采取合適的低溫（如-70℃）存儲以防止樣品中的生化物質(zhì)的降解變質(zhì)，必要時需將樣品分裝保存以防止EBC 樣品的反復(fù)凍融等。
（4）面臨的問題
各種不同品牌的商業(yè)化呼出氣冷凝液采集器被廣泛應(yīng)用于EBC的研究，但研究者也注意到一些問題：（1）環(huán)境條件的不同，采集器裝置和采集操作的不同，都可能導(dǎo)致采集到的呼出氣冷凝液“內(nèi)容物”有所不同。如有研究表明環(huán)境溫度和相對濕度對EBC-pH的變化有貢獻；EBC中的過氧化氫水平在48-140mL/s的呼氣流量下具有流量依賴性等。所以，對不同品牌收集器的呼出氣冷凝液進行比較研究，對EBC收集操作進行標準化也是EBC研究面臨的課題之一。（2）另一個應(yīng)用的難題是EBC是一種含有大量水蒸氣的基質(zhì)，因此大多數(shù)生物標志物被高度稀釋，接近較低的檢測靈敏度極限，有必要建立一個能夠反映氣道中各生物標志物實際水平的EBC稀釋指標，但目前還沒有金標準稀釋因子（gold standard dilution factor）被定義并廣泛用于研究。另外，從采集的角度來看，更有效地采集與富集裝置也有待研究，如研究發(fā)現(xiàn)：將呼出氣冷凝液（EBC）凍干再進行檢測分析，則其生物標志物的濃度可有效提高20倍。
四，總結(jié)與展望
EBC分析是一種有臨床應(yīng)用前景的肺功能指標檢測新技術(shù)。一方面，呼出氣冷凝液(EBC)提供了一種新的診斷呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的生物標志物的標本，通過分析EBC的生物標志物的變化，可提供下呼吸道和肺部可能的病理狀態(tài)的信號，用于疾病早期的診斷、篩查，監(jiān)測病情進程與療效評估，也能為疾病的發(fā)生、發(fā)展機制提供諸多有用信息等。另一方面，呼出氣冷凝液收集設(shè)備具有便攜的特點，且收集不受年齡、性別、病情程度的影響與限制等，幾乎可以應(yīng)用于所有患者，包括小兒患者、機械通氣患者及昏迷患者等。因此，EBC分析作為一種完全無創(chuàng)、簡便快捷、應(yīng)用人群廣泛、可實現(xiàn)疾病動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)勢的新技術(shù)，受到眾多的醫(yī)學(xué)與科研工作者的重視與青睞。
目前EBC的研究還處于臨床應(yīng)用的初級階段，尚還存在著很多亟待解決的問題，其中最主要的問題是“標準化”的問題：如（1）呼出氣冷凝液作為一種如同血液，尿液的生化標本，其組分十分復(fù)雜，尚無大規(guī)模人群的研究報道，缺乏各種生物標志物在EBC中的正常參考值；（2）確定的正常人的呼出氣冷凝液的蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和基因組學(xué)“指紋”還沒有被發(fā)現(xiàn)和沒有被充分描述；（3）現(xiàn)有的知識（knowledge）基于小規(guī)模研究提供的數(shù)據(jù)，通常顯示出相互矛盾的結(jié)果，可能歸因于EBC生物標記物的再現(xiàn)性差；（4）EBC的稀釋度在個體間存在著很大的差異，目前尚缺乏確定EBC稀釋度統(tǒng)一的方法，從而可能會影響對檢測結(jié)果的評估；（5）研究者所用的設(shè)備或收集及檢測方法技術(shù)不同，可能得出不同的結(jié)果，也使得結(jié)果之間缺乏可比性等等。
總而言之，EBC分析是生物醫(yī)學(xué)研究的一項有趣的成就，也是一項有希望成為肺部疾病及全身性疾病診斷的重要技術(shù)。特別是近些年來，隨著基因組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等生命學(xué)科的飛速發(fā)展，同時分子檢測分析技術(shù)也在高速發(fā)展，如高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)，核酸擴增-檢測技術(shù)，以及生物樣品處理與富集技術(shù)的突破與發(fā)展等，為EBC分析開拓了以蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子及細菌病毒微生物氣溶膠為生物標志物的研究新視角和新領(lǐng)域。
主要參考文獻：
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