如何盡可能降低細胞培養(yǎng)中的支原體污染風險

Overview
在細胞培養(yǎng)實驗室中，預防支原體污染可能是一項艱巨的任務。但是，您可以選擇易于清潔的移液器以及無菌耗材并定期檢測，通過執(zhí)行良好的細胞培養(yǎng)規(guī)范，從而顯著降低細胞培養(yǎng)實驗室的支原體污染及傳播風險。

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《盡可能降低細胞培養(yǎng)中的支原體污染風險》應用說明闡述了支原體污染的來源及預防措施。
 

簡介

在細胞培養(yǎng)實驗室中，支原體污染是一種普遍存在的現(xiàn)象：在一項研究中，研究人員測試了 10, 000 個細胞系，發(fā)現(xiàn)其中的 11 % 存在支原體污染。支原體污染如此普遍的部分原因在于，即使在常規(guī)傳代培養(yǎng)中，其也能有效地傳播。而在另一項研究中，研究人員在層流凈化罩中處理受支原體感染的細胞培養(yǎng)物后，在燒瓶外壁、血細胞計數(shù)器上、移液器上以及廢棄培養(yǎng)皿外部都檢測到了活支原體。事實上，甚至在四到六天之后，從層流罩表面也回收到了活支原體。并且在處理過受支原體污染的細胞的同一個層流凈化罩內(nèi)傳代培養(yǎng)純凈的培養(yǎng)物 6 周后，也檢測到支原體呈陽性。

什么是支原體

支原體是一類沒有細胞壁的細菌。由于缺少細胞壁，它們可以呈現(xiàn)不同的形狀，從圓形到細長形都有，并對抗生素具有耐藥性。支原體體積�。�0.2 – 0.8 μm），可穿過除菌級過濾器，這使其成為一種非常難以去除的污染物。此外，體積小也導致其難以在細胞培養(yǎng)中被發(fā)現(xiàn)。

在細胞培養(yǎng)中，支原體可抑制蛋白質(zhì)生物合成以及細胞生長，并會改變RNA和DNA合成，從而影響研究結果。在細胞治療和先進治療藥物產(chǎn)品（ATMP）中，支原體污染會引起免疫反應、染色體畸變或增殖特性改變，從而影響患者的治療安全性。

支原體污染的潛在途徑包括：

1. 受污染的培養(yǎng)基、試劑或儀器
2. 實驗室人員（約 80.6 %的技術人員為支原體攜帶者）
3. 其他實驗室的被感染培養(yǎng)物

支原體留存在移液器表面

移液器經(jīng)常暴露在污染物中，并可能攜帶污染物。通過對移液器高壓滅菌和乙醇擦拭的去污效率比較顯示，用 70 %乙醇去污可使回收到的細菌數(shù)量減少一個對數(shù)級以上，而對移液器進行高壓滅菌可以完全去除其中的支原體污染。

為降低支原體污染風險，請使用可高壓滅菌的移液器進行細胞培養(yǎng)工作。賽多利斯整支可高壓滅菌的Tacta®移液器是細胞培養(yǎng)工作的好選擇。


避免支原體污染的良好實踐

您可以通過以下操作規(guī)程進行無污染的細胞培養(yǎng)：

1   實施良好細胞培養(yǎng)規(guī)范
《良好的細胞培養(yǎng)規(guī)范》中的關鍵指導原則包括：一次只培養(yǎng)一個細胞系；清晰標記用于細胞培養(yǎng)工作的移液器、移液助吸器及移液器吸頭；僅在細胞培養(yǎng)實驗室使用這些移液器和吸頭；禁止將其從細胞培養(yǎng)實驗室轉(zhuǎn)移到另一個實驗室，然后再轉(zhuǎn)移回來。只能使用專為細胞培養(yǎng)工作指定的試劑，不得使用專用于其他應用的儲備溶液。

2  選擇易于清潔且可高壓滅菌的移液器用于細胞培養(yǎng)工作
液體溢漏和飛濺是造成污染的主要來源，而移液器和液體處理控制器的維護在降低這類污染風險方面發(fā)揮著重要的作用。實驗室應針對定期的去除污染和維護作業(yè)制定相關指南和方案。去除細菌污染的有效清潔方法包括：

• 高壓滅菌
• 堿性清潔劑
• 乙醇過氧化氫蒸汽VHP

賽多利斯Tacta®移液器只需拆卸三個部件即可清潔，而且拆卸操作無需使用工具。Tacta® 還可以整支進行蒸汽消毒或熱壓滅菌，它還具有強大的紫外線耐受力和耐化學腐蝕性。

3  選擇帶有防護包裝的無菌濾芯吸頭
濾芯吸頭是細胞培養(yǎng)工作中最安全的選擇，因其為樣本和移液器提供了最好的防護，并且可以防止支原體通過氣溶膠傳播。

4  定期檢測
定期檢測所有細胞系的支原體污染情況，尤其是新細胞系。將新細胞系隔離在單獨的培養(yǎng)箱中，直到可以明確證明其未受支原體污染。

賽多利斯Microsart支原體檢測試劑盒，采用RT-PCR的方法， 3小時內(nèi)即可獲得可靠結果。高特異性Taqman探針，無需擔心假陽性結果，并且完全符合EP 2.6.7法規(guī)要求。

5  使用 0.1 μm的濾器過濾
高壓滅菌是殺死支原體的有效方法，但不適用于某些培養(yǎng)基和試劑，因為高溫會破壞許多營養(yǎng)素和生長因子。對于細胞大小為 0.2 - 0.8 μm且可通過孔徑大于 0.1 μm孔的支原體而言，能有效防止細菌和真菌通過的孔徑為 0.22 μm的標準無菌過濾通常是不夠的。因此，為防止支原體污染，在過濾細胞培養(yǎng)試劑和培養(yǎng)基時，應使用 0.1 μm孔徑的無菌過濾器，而不是標準的 0.22 μm過濾器。