共聚焦顯微鏡的成像原理及應(yīng)用

什么是共聚焦顯微鏡？
共聚焦顯微鏡是激光共聚焦掃描顯微鏡 LCSM 的簡稱，它顯微成像主要采用 3D 捕獲的成像技術(shù)，使其具有較高的三維圖像分辨率。這 些都是 通過構(gòu)建顯微照片來實(shí)現(xiàn)的。在熒光顯微鏡使用過程中，由于需要高強(qiáng)度紫外光輔助成像，所以顯微鏡 內(nèi)的汞弧燈產(chǎn)生的強(qiáng)光可能會(huì)導(dǎo)致令人不安的背景噪音，甚至?xí)��?dǎo)致光漂白。 共聚焦顯微鏡原理是通過數(shù)碼相機(jī)針孔的高強(qiáng)度激光來實(shí)現(xiàn)數(shù)字成像的技術(shù)，有效避免了熒光顯微鏡 所產(chǎn)生 的問題。

共焦顯微鏡原理
共聚焦顯微鏡中的圖像是來自一個(gè)焦平面的光通過針孔數(shù)碼相機(jī)聚焦拍攝，從而規(guī)避 來自其支點(diǎn)上方或下方的光。固定在設(shè)備上的激光連續(xù)聚焦在樣品的選定區(qū)域，同時(shí)，被樣品吸附的熒光染料也會(huì)被數(shù)碼相機(jī)捕捉。共聚焦設(shè)備包含兩個(gè)旋轉(zhuǎn)鏡頭用來拍攝組圖。

然后通過所累積的不同焦平面的圖像序列，使用軟件編譯完整的 3d 圖像。此圖像可以在軸向（z 軸）和橫向（x 和 y 軸）平面進(jìn)行微調(diào)。這些細(xì)胞和其他矩陣的再現(xiàn)是通過使用雙倒置的光錐照亮物體來實(shí)現(xiàn)的。

使用標(biāo)準(zhǔn)落射熒光顯微鏡所存在的問題是當(dāng)遇到較厚的基質(zhì)或標(biāo)本時(shí)所表現(xiàn)出的熒光程度較大。大于 2 微米的樣品發(fā)出的輻射會(huì)危及生成圖像的準(zhǔn)確性，從而損失成像的細(xì)節(jié)。而共聚焦顯微鏡則可以通過縮小激發(fā)范圍并使用光學(xué)切片來消除背景噪聲。



共聚焦顯微鏡的應(yīng)用 

ECM模擬凝膠的成像
細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 或?qū)儆谒�有�?xì)胞的非細(xì)胞成分，在細(xì)胞功能中是必不可少的。ECM 的彈性調(diào)節(jié)細(xì)胞的許多生物學(xué)功能，例如間充質(zhì)干細(xì)胞的分化、粘附和遷移。

細(xì)胞生物學(xué)中常常通過水凝膠來模擬ECM。共聚焦顯微鏡的應(yīng)用主要在于可與聚丙烯酰胺凝膠的壓痕法結(jié)合使用。共聚焦自動(dòng)圖像成像可以有效測量 ECM 模擬中的壓痕和穿孔。比如，共聚焦激光顯微鏡可以測量出 PAAM 凝膠組合物的深度和剛度。這種方法可以替代 AFM 納米壓痕法和微針法。
由于共焦成像可以可靠地探測大多數(shù)樣品表面下方 0-200 µm 之間的任何位置。然而，重要的是要注意，每個(gè)樣本都有自己指定的深度，在該深度處散射、光漂白和噪聲太高。據(jù)說有些標(biāo)本應(yīng)該完全避免使用共聚焦顯微鏡。

替代雙光子顯微鏡功能 
雙光子顯微鏡或多光子顯微鏡產(chǎn)生兩個(gè)光子來完成一個(gè)光子的工作。當(dāng)獲取兩個(gè)光子，每個(gè)光子具有一半的能量，快速連續(xù)退出時(shí)，這個(gè)過程將取決于撞擊樣品的光強(qiáng)度的平方。

以大約 100 MHz 脈沖的紅外激光器將使失焦光比聚焦光暗得多。

雙光子顯微鏡的散射光不會(huì)激發(fā)熒光，因?yàn)樗�使用的紅外波比高強(qiáng)度激光散射的少。這將較大程度地減少信號(hào)損失并可以穿透大約 1 mm 的組織，超過共聚焦顯微鏡穿透 200 μm 組織的能力。較低能量的紅外光對細(xì)胞造成的損害也會(huì)降低。

根據(jù)電子顯微鏡的成像規(guī)則，我們可以知道共聚焦顯微鏡的分辨率遠(yuǎn)高于雙光子顯微鏡。雖然，共焦顯微鏡比傳統(tǒng)的熒光顯微鏡要強(qiáng)大得多，但雙光子顯微鏡和透射電子顯微鏡的市場應(yīng)用更為普遍。