類器官分析指南：三個步驟與四大應(yīng)用

相比于2D細胞模型，類器官能夠更真實地反映和模擬體內(nèi)真實的生理和病理環(huán)境。發(fā)展至今，類器官在精準醫(yī)療、藥物發(fā)現(xiàn)、再生醫(yī)學(xué)及疾病建模等多個研究領(lǐng)域表現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。盡管很多應(yīng)用還處于早期開發(fā)階段，但類器官為疾病研究提供新的機會，并為現(xiàn)有的細胞系和動物模型提供重要補充。  
 
類器官培養(yǎng)與分析的痛點
包括美國菌種保藏中心（ATCC）在內(nèi)的多個組織和研究機構(gòu)發(fā)布許多針對多種類器官培養(yǎng)的protocol，定義了其培養(yǎng)條件、接種密度、基質(zhì)建議和其他關(guān)鍵參數(shù)。但是對類器官的定量分析面臨重重挑戰(zhàn)：
 

• 每個孔中類器官形成的重復(fù)性無法保證，缺少成熟的實驗方案
• 檢測和數(shù)據(jù)通量低
• 費時耗力，需要手動操作獲取類器官圖像
• 需要借助第三方軟件做分析——定量信息有限
• 圖像采集過程中的環(huán)境控制不到位，導(dǎo)致結(jié)果可信度不高

 
賽多利斯Incucyte®實時活細胞分析系統(tǒng)可謂應(yīng)時而生。
 

• 專有的明場（BF）圖像采集能夠可視化、定量化地監(jiān)測類器官在Matrigel® domes中形成和生長的動力學(xué)；
• 通過自動繪制類器官尺寸、計數(shù)和形態(tài)隨時間變化的圖譜，提供關(guān)于分化和成熟的定量數(shù)據(jù)；
• 置于培養(yǎng)箱中直接進行分析，避免類器官所需生理環(huán)境被干擾。

   
 
三個步驟
“一加、二拍、三分析”


 
Incucyte® 分析Matrigel® domes培養(yǎng)類器官的實驗流程。能夠輕松培養(yǎng)、擴增和維護類器官培養(yǎng)物，反映相應(yīng)器官的生理學(xué)。
 
 
四大應(yīng)用
 
1. 類器官生長
2. 類器官培養(yǎng)條件
3. 類器官成熟階段
4. 類器官分化及生長效率
 
Incucyte®類器官分析簡單實用，一學(xué)就會！


應(yīng)用1：監(jiān)測并量化類器官生長

應(yīng)用亮點：Incucyte®能夠在長達數(shù)天、數(shù)周甚至數(shù)月的時間內(nèi)，對多種組織樣本進行定量分析。檢測過程發(fā)生在穩(wěn)定的培養(yǎng)箱環(huán)境中，避免來回取放培養(yǎng)板對類器官生長造成的影響。

使用Incucyte®及類器官分析軟件對生長于Matrigel® dome培養(yǎng)的三種不同類器官的生長情況進行監(jiān)測（圖1，左：腸道類器官；中：胰腺類器官；右：肝臟類器官）。頂行顯示了接種后6天后三種不同類型類器官的單一對焦BF二維圖像；中間行為頂行方框內(nèi)放大后的圖像，顯示了細胞類型的具體形態(tài)特征。底行顯示了單個孔中BF區(qū)域面積（μm2）隨時間的變化，證明了特定細胞類型的類器官生長。成熟的肝臟和胰腺類器官表現(xiàn)出相似的大小和快速生長能力，而腸道類器官則顯得較小，并在成熟時表現(xiàn)出明顯的發(fā)芽形態(tài)。 圖1. 在Matrigel® Dome中捕獲和量化三種不同類器官的生長。將小鼠腸道（1:3傳代，50% Matrigel®）、胰腺（1:5傳代，100% Matrigel®）和肝臟類器官（1:40傳代，100% Matrigel®）嵌入24孔板的Matrigel® Dome中，并在Incucyte®系統(tǒng)中每6小時用4倍鏡采集一次圖像。每個數(shù)據(jù)點代表均值±SEM，n=4個孔。
 
 
應(yīng)用2：優(yōu)化類器官培養(yǎng)條件

應(yīng)用亮點：Incucyte®能夠?qū)崟r、連續(xù)地監(jiān)測類器官形成的動力學(xué)數(shù)據(jù)，捕捉細胞形態(tài)變化，從而客觀地評估生長條件和接種密度的影響，并確定最大化擴增所需的條件。

使用Incucyte®篩選小鼠肝臟類器官的最佳培養(yǎng)條件。首先將小鼠肝臟類器官以多種密度接種到Matrigel® Dome中，通過Incucyte®軟件自動對其尺寸和計數(shù)進行分析。接種5天后獲取的BF圖像和時間曲線（圖2）。結(jié)果顯示類器官大小和生長率與細胞數(shù)量成正比。以最高密度接種的類器官較大（直徑>500 μm），并表現(xiàn)出快速生長的特點，在120小時達到最大尺寸。而在較低的密度下，類器官的成熟階段延長，且具有最大的生長潛力（平均面積時程曲線）。 圖2. 確定類器官擴增的最優(yōu)條件將小鼠肝臟器官嵌入Matrigel® Dome（100%），在48孔板中以多種密度接種。接種后五天獲取BF圖像。每隔6小時收集數(shù)據(jù)，總計168小時。4倍鏡拍攝所有圖像。每個數(shù)據(jù)點代表均值±SEM，n=14個孔。
 
 
應(yīng)用3：鑒定類器官最佳成熟階段

應(yīng)用亮點：Incucyte® 能夠?qū)崟r、定量分析類器官偏心率、暗度等細胞形態(tài)的變化，快速、精確地評估最佳培養(yǎng)傳代周期，為下游實驗打好基礎(chǔ)。

為了確定嵌入Matrigel® Dome中的小鼠肝臟類器官的最佳傳代頻率，使用Incucyte®對培養(yǎng)物進行了8天的圖像采集（圖3）。通常情況下，肝臟類器官在達到最大生長限并且沒有萎陷時就可以進行傳代。BF圖像顯示，接種兩天后，大多數(shù)類器官的直徑小于100 μm，并且有清晰的腔隙，不適合傳代。隨后48小時內(nèi)觀察到偏心率的下降（見最右側(cè)時間曲線），類器官接近圓形。該培養(yǎng)物傳代的最佳時期發(fā)生在第4天和第5天之間，此時Dome內(nèi)的大多數(shù)類器官已達到最大尺寸，呈圓形且沒有萎陷。第6天的圖像和時間曲線表明，達到最大尺寸的類器官已經(jīng)萎陷且變暗。


圖3：使用綜合形態(tài)定義特定細胞類型的傳代頻率。將肝臟類器官嵌入24孔板中的100% Matrigel® Dome（1:10傳代）。每隔6小時收集數(shù)據(jù)，總計192小時。4倍鏡拍攝所有圖像。每個數(shù)據(jù)點代表均值±SEM，n=6個孔。
 
 
應(yīng)用4：實時監(jiān)測類器官分化及生長效率

應(yīng)用亮點：Incucyte®長時間連續(xù)成像和分析的能力能夠?qū)︻惼鞴贁U增提供可靠、可重復(fù)的評估。通過類器官軟件能夠動態(tài)、客觀地量化多個參數(shù)，更高效且簡便地評估延長傳代期時類器官的擴增和生長效率。

在此案例中，當傳代密度保持一致時，隨著時間的推移，腸道類器官表現(xiàn)出重復(fù)性較高的計數(shù)、面積、偏心率和暗度值。此外，接種后第7天的BF圖像證實了對明確出芽表型的維持狀態(tài)。 圖4. 評估多次傳代的類器官生長和分化效率。將腸道類器官嵌入50%的Matrigel® Dome（1:3傳代，24孔板），經(jīng)過多次傳代，確定其隨著時間推移的生長和分化一致性。每隔6小時收集數(shù)據(jù)，總計192小時。4倍鏡拍攝所有圖像。每個數(shù)據(jù)點代表均值±SEM，n=6個孔。
 
 
Summary
Incucyte® 實時活細胞分析系統(tǒng)，結(jié)合Incucyte®類器官分析軟件可促進對類器官形成和生長過程動態(tài)、定性、準確的評價，使類器官培養(yǎng)與分析不再困難。
 
 
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賽多利斯電子書《類器官與藥物發(fā)現(xiàn)》，匯總了3D類器官模型在腫瘤學(xué)、新藥發(fā)現(xiàn)、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)等研究的學(xué)習(xí)資源，總結(jié)并介紹了實時活細胞分析技術(shù)在3D細胞及類器官培養(yǎng)研究中的實驗操作及應(yīng)用案例。
-參考文獻-
Sato T, Vries RG, Snippert HJ, van de Wetering M, Barker N, Stange DE, van Es JH, Abo A, Kujala P, Peters PJ, Clevers H. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 459: 262–265, 2009.